Transduction et transfection in vitro et in vivo de vecteurs aav-mdr1

par MARION BAUDARD

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de JEAN PIERRE MARIE.

Soutenue en 1999

à Paris 7 .

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  • Résumé

    Nous avons clone des plasmides (aav-mdr1) dans lesquels l'adnc du gene mdr1 humain (codant pour le transporteur membranaire pgp) est place sous la dependance de sequences de l'extremite 5 du genome aav. Le phenotype de resistance confere par l'expression de pgp a ete utilise pour selectionner les cellules humaines ou murines transfectees avec ces plasmides. L'importante activite transcriptionnelle du promoteur aav p5 (equivalente a celle du ltr du virus de sarcome murin harvey du plasmide controle) et des sequences aav situees en amont de p5 a ete demontree. L'utilisation de ces promoteurs de taille reduite a permis la production de particules aavr contenant l'adnc mdr1 dont la taille est proche de la limite pour un empaquetage efficace. L'analyse par southern blot des adns genomiques et de bas poids moleculaire extraits des cellules nih3t3 transfectees a revele la persistance de formes non integrees intactes des plasmides aav-mdr1. Par ailleurs, l'integration des sequences transfectees dans le genome de la cellule hote a ete demontree par hybridation in situ. L'expression de pgp est restee stable a la surface des cellules mdr1 transfectees maintenues en culture en presence continue d'un agent cytotoxique de pgp, mais a disparu de la surface des cellules transduites. L'expression de l'adnc codant pour la glucocerebrosidase humaine a ete observee dans des cellules transfectees avec un plasmide bicistronique contenant une cassette transcriptionnelle adnc hmdr1 - sequence ires virale - adnc hgc, et selectionnees par le phenotype de resistance. Apres injection intraveineuse de ce plasmide bicistronique complexe a des liposomes cationiques a des souris, les sequences hmdr1 et hgc ont ete retrouvees dans la plupart des organes des souris analyses. Des formes non integrees du plasmide bicistronique ont ete detectees par analyse par southern blot d'adns extraits des foies et l'expression de pgp a pu etre mise en evidence par analyse en cytometrie de flux de suspensions de cellules hepatiques pour de rares souris sacrifiees a des temps precoces post-injection.

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Informations

  • Détails : 206 p.
  • Annexes : 296 ref.

Où se trouve cette thèse ?

  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • Accessible pour le PEB
  • Cote : TS1999
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