Caracterisation enzymatique et physicochimique d'un enzyme qui catalyse la formation de plusieurs pseudouridines dans les arn de transfert chez s. Cerevisiae : la pseudouridine synthetase pus1

par VERONIQUE ARLUISON

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de Michel Morange.

Soutenue en 1999

à Paris 6 .

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  • Résumé

    La proteine pus1 de s. Cerevisiae catalyse l'isomerisation de l'uridine en pseudouridine () a differentes positions de certains arnt. Le gene pus1 a ete clone et hyperexprime chez e. Coli avec 6 histidines en son extremite n-terminale, afin de purifier aisement la proteine recombinante sur colonne de ni 2 +-nta. En solution, la proteine pus1 recombinante existe majoritairement sous forme de monomeres, mais se presente egalement sous forme d'oligomeres et d'agregats. L'utilisation d'un detergent, le dodecyl--d-maltoside, est indispensable afin de maintenir pus1 en solution, surtout a haute concentration en proteine. L'interaction de pus1 avec differents arnt a ete etudiee. L'affinite de pus1 est generale pour tous les arnt, qu'ils soient substrats (presence d'une uridine cible) ou non. Les constantes d'equilibre de dissociation des complexes pus1 : arnt (k d), mesurees par la technique retention sur filtre de nitrocellulose, varient de 15 nm pour l'arnt v a l substrat, et l'arnt p h e non substrat, a 150 nm pour l'arnt i l e substrat. L'importance de l'architecture de l'arnt a ete etudiee avec des mutants deletes pour les tiges-boucles t et d, ou impliques dans la formation de paires de bases maintenant sa structure tridimensionnelle. Bien que non necessaire pour l'activite de l'enzyme, la presence d'une liaison tertiaire g26-a44, absente dans l'arnt i l e, est un element important pour la reconnaissance de l'arnt avec une haute affinite (k d = 15 nm). La presence de cette liaison tertiaire augmente la vitesse d'association de l'arnt a l'enzyme d'un facteur 100 environ, resultant en une diminution globale de la constante d'equilibre de dissociation. Ces constantes ont ete mesurees par la technique de resonance des plasmons de surface. Nous avons de plus montre par spectroscopie atomique d'absorption, que la proteine recombinante pus1 contient un atome de zinc par monomere. Pus1 est le premier exemple d'une pseudouridine synthetase contenant un ion zinc. Un enzyme deplete en zinc peut etre obtenu apres dialyse contre l'agent chelatant 1,10-phenanthroline. La perte du zinc resulte en l'inactivation de l'enzyme avec la perte concomitante de sa capacite a lier l'arnt. Elle provoque egalement un changement de structure tridimensionnelle de pus1 (determine par ultracentrifugation analytique), avec un changement mineur de son organisation interne (determine par uvcd, ftir ou fluorescence). Nos resultats sont en accord avec un role structural pour le zinc, qui maintiendrait l'association entre des domaines structuraux de pus1. Enfin, dans un extrait de levure, pus1 existe sous deux formes reconnues par les anticorps polyclonaux anti-pus1 (technique de western blot) et de poids moleculaires autour de 63kda,. Une etude precise de la localisation de pus1 par immunocytochimie en microscopie electronique a permis de mettre en evidence la presence de pus1 dans le noyau, essentiellement au niveau de la membrane nucleaire, mais egalement dans la mitochondrie. La presence de pus1 dans ces deux compartiments cellulaires explique vraisemblablement l'existence des deux formes de l'enzyme dans la levure. Ce travail constitue la premiere analyse physicochimique et enzymatique de pus1 et permet de montrer quelles sont les directions a prendre pour les futures recherches la concernant.


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Informations

  • Détails : 196 p.
  • Annexes : 250 ref.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
  • Consultable sur place dans l'établissement demandeur
  • Cote : T Paris 6 1999 19
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 1999
  • Bibliothèque : École normale supérieure. Bibliothèque.
  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : LBPA / THE ARL
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