Organisation moleculaire et relation structure-fonction du represseur argr de la bacterie thermophile moderee bacillus stearothermophilus

par IOVKA KARAIVANOVA MILTCHEVA

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de VEHARY SAKANYAN.

Soutenue en 1999

à Nantes .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    Le represseur thermostable argr de bacillus stearothermophilus est un hexamere forme par l'association de deux trimeres en presence d'arginine. Des approches genetiques, biochimiques et structurales ont permis d'elucider, in vivo et in vitro, les particularites fonctionnelles et structurales de la proteine argr. Les acides amines conserves dans le domaine n-terminal, implique dans l'interaction avec l'adn et dans le domaine c-terminal, implique dans l'oligomerisation de la proteine, ont ete remplaces par mutagenese dirigee. Les mutants obtenus ont ete testes pour leur capacite a reprimer, dans des cellules d'escherichia coli, l'expression du gene rapporteur lacz en fusion avec la region promoteur-operateur argc de b. Stearothermophilus. Le remplacement d'acides amines localises dans les helices 2 et 3 du motif winged helix-turn-helix diminue fortement la repression. Cette diminution de la capacite des mutants a se lier a l'adn a pu etre confirmee in vitro. Chez e. Coli, il a ete montre que le represseur sauvage argr de b. Stearothermophilus se comportait comme un super-represseur. En effet, en l'absence d'arginine, des cellules recombinantes d'e. Coli portant le represseur argr de b. Stearothermophilus sur un vecteur multicopie ne se developpent pas en milieu minimum. Tous les mutants affectes dans le domaine d'interaction avec l'adn ont perdu leur fonction de super-represseur. Le remplacement de residus leucine dans les feuillets 3 et 4 du domaine de l'oligomerisation d'argr par d'autres acides amines hydrophobes s'est revele neutre ou entrainant soit une derepression soit une super repression accentuee. Dans certains double-mutants, le remplacement de leu87 par une phenylalanine augmente l'affinite de argr vis a vis de l'operateur et la proteine mutee devient plus soluble. Des proteines chimeres d'argr, renfermant le domaine d'interaction avec l'adn de b. Stearothermophilus et le domaine de l'oligomerisation d'e. Coli, presentent des affinites plus importantes pour l'operateur thermophile argc et l'operateur mesophile carab. En l'absence d'arginine, des experiences d'exclusion-diffusion ont montre que les proteines chimeres s'organisaient en trimeres. Toutefois la dependance stricte et accrue de ces chimeres vis a vis de l'arginine pour leur fonctionnalite montre que celles-ci se lient a l'operateur sous la forme d'hexameres. La longueur du peptide de liaison entre les deux domaines des chimeres n'influence pas leur capacite a se lier a l'adn. Cependant aucune de ces proteines n'est capable de reprimer l'expression du gene rapporteur chez e. Coli. De plus, les proteines chimeres renfermant le domaine d'interaction avec l'adn d'e. Coli ne peuvent plus se lier a l'adn, meme in vitro. Les resultats obtenus soulignent que, pour etre fonctionnel, le represseur thermostable argr necessite un repliement correct de l'oligomere et des deux domaines des monomeres et tres certainement d'autres interactions de type proteines-proteines. En effet, des resultats genetiques prouvent que la sous-unite de l'arn polymerase d'e. Coli reconnait l'element up situe dans la region promotrice-operatrice argc de b. Stearothermophilus. Enfin du fait de la grande flexibilite du domaine d'interaction avec l'adn du represseur argr de b. Stearothermophilus, les resultats presentes sont en faveur d'un role multifonctionnel de argr vis a vis de nombreux sites operateurs impliquant ou non l'arginine.


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  • Détails : 179 p.
  • Annexes : 240 ref.

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  • Bibliothèque : Université de Nantes. Service commun de la documentation. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 99 NANT 2094
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