Caractérisation "in vitro" de transporteurs d'efflux deNO3 sur la membrane plassmique de cellules de tabac BY-2 (Nicotiana tabaccum L. )

par Mériam Espuna

Thèse de doctorat en Physiologie

Sous la direction de Rémy Gibrat.

Soutenue en 1999

à Montpellier 2 .


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  • Résumé

    Des cellules de tabac de la lignee by-2 ont ete cultivees en suspension dans un milieu standard riche ou pauvre en no#3#-. La membrane plasmique a ete isolee et reconstituee dans des phospholipides de soja afin d'obtenir des vesicules tres etanches aux petits ions. Le flux net passif de no#3#- dans ces dernieres a ete determine a l'aide d'une nouvelle methode electrophysiologique in vitro. Deux transporteurs d'efflux de no#3#- ont ete mis en evidence. L'un, de ph optimum 5,5, est constitutif. L'autre, de ph optimum 7,0 est induit lorsque les cellules sont cultivees en presence d'un exces de no#3#-. Les deux transporteurs sont actives par le voltage (optimum de 95 mv). Les roles physiologiques potentiels des deux transporteurs sont evoques. Une strategie biochimique d'identification des polypeptides de transport a ete engagee. Une nouvelle methode de broyage cellulaire par cavitation haute pression de rendement tres eleve a ete utilisee. Les proteines extrinseques de la membrane plasmique ont ete eliminees par un lavage au triton x-100, puis les proteines intrinseques ont ete solubilisees par le zwittergent 3-14. Ces dernieres sont bien separees par chromatographie fplc d'echange d'anions et d'exclusion sterique. La reinsertion des proteines des fractions dans des liposomes a ete optimisee. L'activite du transporteur constitutif a ete recherchee a ph 5,5 dans les fractions eluees a partir de deux colonnes d'echange d'anions. Les profils sds-page ont ete analyses parallelement dans les fractions. Trois bandes polypeptidiques candidates ont ete reperees par correlation entre leur abondance et l'activite de transport. Elles ne contiennent pas de polypeptide glycosyle. Des anticorps polyclonaux ont ete produits. Par ailleurs, des indications de l'existence dans la membrane plasmique d'autres transporteurs passifs d'anions ont ete obtenues en ce qui concerne cl#- et no#2#-.

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Informations

  • Détails : [7], 105 f
  • Annexes : Bibliogr.: f. 93-105

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  • Bibliothèque : Bibliothèque interuniversitaire. Section Sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TS 99.MON-26
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