La protéase LasA de Pseudomonas aeruginosa : purification et caractérisation de son activité enzymatique vis-à-vis de peptides d'élastine, par électrophorèse capillaire et spectrométrie de masse LSIMS

par Sandrine Vessillier

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Jean Wallach.

Soutenue en 1999

à Lyon 1 .

Le président du jury était Jean Wallach.


  • Résumé

    Pseudomonas aeruginosa est une bacterie pathogene opportuniste responsable d'infections graves chez les patients immunodeprimes. Dans le cas de la mucoviscidose, la colonisation du tissu pulmonaire par la bacterie s'effectue au detriment de staphylococcus aureus. En effet, parmi les proteases secretees par p. Aeruginosa, la protease lasa possede une activite staphylolytique et peut hydrolyser la pentaglycine du peptidoglycanne de la paroi de s. Aureus. Lasa est egalement capable d'augmenter l'activite elastolytique d'elastases et d'autres proteases comme la thermolysine. Afin de rechercher si l'activite elastolytique est liee a la preference de la protease pour les substrats riches en glycine, nous avons synthetise, en phase solide, les 65 pentapeptides presents dans la sequence de la tropoelastine et possedant au moins trois glycines, consecutives ou non. Leur hydrolyse, etudiee par electrophorese capillaire et par spectrometrie de masse lsims, a montre que les sequences preferentiellement hydrolysees par lasa contiennent gg a ou gg g. Ces resultats ont ete confirmes par l'hydrolyse des sequences (19-35, 637-656 et 642-656) de l'elastine. Leur hydrolyse par l'elastase de p. Aeruginosa et par l'elastase leucocytaire a montre des differences notables quant a la vitesse d'hydrolyse et l'emplacement des sites de coupure indiquant une activite elastolytique distincte pour chacune des trois enzymes. Nous avons precise la specificite de lasa en etudiant l'hydrolyse de 68 pentapeptides analogues a ceux presents dans l'elastine. L'activite de l'enzyme est fortement liee a la presence de glycines consecutives en position interne. Les peptides possedant la sequence gg x interne sont plus rapidement hydrolyses que ceux contenant la sequence g x (x = g,a,y,f). Ainsi, une glycine en position p 1 est necessaire alors qu'un acide amine de faible encombrement sterique ou aromatique en p 1 permet l'hydrolyse. Les sites p 2 et p 2 doivent etre occupes pour que l'hydrolyse ait lieu et la vitesse d'hydrolyse est largement augmentee si le site p 3 l'est egalement. Notre etude sur specificite de lasa, pourrait permettre, notamment, la synthese d'inhibiteurs competitifs de la protease.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (273 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 157-273

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  • Bibliothèque : Université Claude Bernard (Villeurbanne, Rhône). Service commun de la documentation. BU Sciences.
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