Régulation de l'expression de l'aspartyl protéase chez Penicillium roqueforti

par Stéphanie Gente

Thèse de doctorat en Sciences

Sous la direction de Michel Fèvre.

Soutenue en 1999

à Lyon 1 .

Le président du jury était Michel Fèvre.


  • Résumé

    Ce travail traite de l'etude de la regulation de l'expression de l'aspartyl protease chez penicillium roqueforti. Le criblage d'une banque d'adn genomique de p. Roqueforti avec un fragment pcr amplifie a partir d'oligonucleotides degeneres a permis d'isoler un clone contenant le gene aspa codant pour une aspartyl protease secretee. Le mode d'expression de l'aspartyl protease en fonction des variations des conditions environnementales (source de carbone, d'azote et ph) a ete suivi a l'aide de tests biochimiques (degradation de caseine) et au niveau moleculaire (northern blot). Cette analyse a revele que l'expression du gene est soumise a la regulation azote : induction par une source proteique (caseine) et repression par une molecule simple (ammonium). Aspa est ph regule, exprime a ph 2. 5 et 5. 5 mais non a ph 7. 5. L'analyse de la sequence promotrice a revele la presence de sites consensus de fixation de transregulateurs azote et ph identifies chez aspergillus nidulans et des experiences de retardement de migration ont mis en evidence la fixation de proteines sur le promoteur d'aspa. Le gene aspa etant soumis a la regulation azote, nous avons entrepris le clonage du gene nmc qui code pour un facteur de transcription positif appartenant a la famille des facteurs gata caracterise par un doigt de zinc de type cys 2-cys 1 7-cys 2-cys. L'expression de nmc a ete etudiee, elle est reprimee par une source d'azote simple comme l'ammonium et induite par une source d'azote complexe comme la caseine ou le nitrate. Afin de determiner le role de nmc dans l'induction de la transcription d'aspa, nous avons isole un mutant nmc et etudie la production d'aspartyl protease chez cette souche. Il apparait que l'expression d'aspa est divisee par dix chez ce mutant par rapport au sauvage confirmant le role inducteur joue par nmc. L'etude de l'expression d'aspa en fonction du ph de culture a ete approfondie a l'aide d'une technique de transfert de mycelium et en suivant l'apparition des transcrits et de la proteine aspa. Cette analyse a demontre que le ph ne joue pas un role direct sur la repression de la transcription d'aspa par l'intermediaire d'un transregulateur global mais si il bloque l'activite de l'aspartyl protease secretee, empechant ainsi la degradation de la caseine et au dela la liberation de peptides inducteurs de la voie des proteases. Enfin, une souche protease deficiente (p20) obtenue par transformation integrative a ete etudiee afin de caracteriser le gene interrompu au cours de la transformation. Un fragment de gene flanquant l'integration du vecteur de transformation a ete isole. Ce gene code pour une proteine sans signature particuliere et qui est retrouvee chez de nombreuses especes comme l'homme, les plantes ou encore la levure, ce qui indique que cette proteine doit jouer un role capital dans le fonctionnement cellulaire.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (215 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 195-213

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