La formiate déshydrogénase aérobie d'Escherichia coli : rôle physiologique, étude topologique et analyse de la transcription de l'opéron fdoGH

par Stéphane Benoît

Thèse de doctorat en Biochime

Sous la direction de Marie-Andrée Mandrand.


  • Résumé

    En plus de la voie respiratoire anaérobie majeure constituée de la formiate déshydrogénase FDH-N et de la nitrate réductase NAR-A qui couplent l'oxydation du formiate à la réduction du nitrate, Escherichia coli synthétise en aérobiose les deux iso-enzymes FDH-0 et NAR-Z. Par le suivi de l'activité enzymatique de différents mutants, nous avons montré que FDH-0 est capable de transférer les électrons à NAR-Z lors d'une transition soudaine de l'aérobiose à l'anaérobiose, ce qui permet à la cellule de s'adapter en attendant la mise en place de la voie majeure. La topologie du complexe hétérotrimérique membranaire FDH-0 a été étudiée en construisant dans chacune des trois sous-unités des fusions avec la protéine rapporteur β-lactamase, qui confère la résistance à l'ampicilline. Dans le modèle obtenu, la sous-unité catalytique FdoG et la sous-unité de transfert d'électrons FdoH sont localisées dans le cytoplasme, la partie C-terminale de FdoH étant ancrée dans la membrane, alors que Fdol possède quatre segments transmembranaires, en accord avec son rôle d'apoprotéine du cytochrome b. Ce modèle a été confirmé par des expériences d'accessibilité aux protéases du complexe intégral FDH-0 dans des sphéroplastes. Nous avons mis en évidence que les gènes fdoG, fdoH et fdoIcodant pour les trois sous-unités de FDH-0 sont organisés en opéron. Le site d'initiation de la transcription de fdo a été déterminé par extension d'amorce. La régulation de l'opéron fdo a été étudiée dans différentes conditions rédox en suivant l'influence de délétions et de mutations ponctuelles dans la région promoteur-opérateur sur l'expression d'une fusion d'opérons entre fdo et le gène rapporteur de la β-glucuronidase uidA. .

  • Titre traduit

    = The aerobic formate dehydrogenase of Escherichia coli : physiological role, topological study and transcription al analysis of the fdoGHJ operon


  • Résumé

    Besides the major anaerobic pathway involving formate dehydrogenase FDH-N and nitrate reductase NAR-A, which catalyse formate oxidation coupled to nitrate reduction, Escherichia coli synthesizes two aerobically expressed isoenzymes, FDH-0 and NAR-Z. Using various mutants, we have shown that FDH-0 and NAR-Z were able to reduce nitrate at the expense of formate under anaerobic conditions, suggesting that this path"way would allow the cell to respond quickly to anaerobiosis. The topology of the three subunits of the membrane-bound enzyme complex FDH-0 has been studied by using blaM (β-lactamase) gene fusions. Our data suggest that the αβ catalytic dimer is located in the cytoplasm, with a C-terminal anchor for protruding into the periplasm. As expected, the y subunit, which specifies cytochrome b, was shown to cross the cytoplasmic membrane four times. Protease digestion studies of the 35Slabelled FDH-0 heterotrimer in spheroplasts add further support to this model. We have provided evidence that thefdoG,fdoH andfdol genes encoding the three subunits of FDH-0 are organized as an operon. The fdo transcription start site has been identified by a primer extension experiment. Using a transcriptional fusion to the uidA gene encoding β-glucuronidase, we have analyzed the regulation of the fdo operon under different conditions redox by studying the effect of deletions and mutations in the promoter-operator region.

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Informations

  • Détails : 1 vol. (163 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr.p.136-156

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  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées (Villeurbanne, Rhône). Service Commun de la Documentation Doc'INSA.
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