Ingenierie moleculaire de la ferredoxine 2fe-2s de clostridium pasteurianum. Caracterisation de proteines homologues chez azotobacter vinelandii et aquifex aeolicus

par CLAIRE CHATELET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de JACQUES MEYER.

Soutenue en 1999

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Parmi les nombreuses proteines contenant des sites actifs 2fe-2s, la ferredoxine de clostridium pasteurianum a longtemps paru unique, il s'avere cependant qu'elle possede des homologues dans de nombreux organismes procaryotes et eucaryotes. Les etudes decrites ici sur la ferredoxine 2fe-2s de c. Pasteurianum (2fecpfd) et sur deux de ses homologues chez azotobacter vinelandii (2feavfd i) et aquifex aeolicus (2feaafd) ont abouti aux resultats suivants. Une flexibilite inhabituelle de l'environnement du site actif 2fe-2s de 2fecpfd a ete mise en evidence. Deux sites d'echange de ligands ont notamment ete decouverts et il est possible de mimer la distribution des ligands cysteine d'autres proteines 2fe-2s, modifiant ainsi le chromophore de 2fecpfd. Cependant, aucun residu autre que cysteine n'a le pouvoir de coordiner de facon stable l'agregat 2fe-2s, a l'exception d'un residu serine sur l'atome de fer reductible. La rmn bidimensionnelle a ete envisagee pour obtenir des informations sur la structure de 2fecpfd, mais cette proteine se prete mal a de telles etudes en raison de son paramagnetisme et de sa taille (dimere de 24 kda). Nous avons tente de la monomeriser par mutagenese dirigee, mais sa structure quaternaire est apparue difficile a destabiliser. La fonction de 2fecpfd reste a ce jour inconnue, bien qu'elle semble impliquee dans la fixation de l'azote, comme le suggere la mise en evidence d'une interaction specifique avec la proteine a molybdene et fer de la nitrogenase. Les residus de 2fecpfd impliques dans cette interaction ont ete identifies par mutagenese dirigee et reticulation covalente. Azotobacter vinelandii est une bacterie diazotrophe, comme c. Pasteurianum, mais est plus facile a manipuler genetiquement. Le gene codant 2feavfd i a ete clone et surexprime chez escherichia coli. L'effet de la deletion de ce gene sur la croissance d'a. Vinelandii est en cours d'etude. Le clonage et l'expression chez e. Coli du gene codant 2feaafd a permis la caracterisation d'une proteine hyperthermophile de cette famille. L'etude cristallographique de cette proteine est en cours et devrait fournir un modele structural pour l'ensemble des proteines de ce type. La question de savoir si 2fecpfd, 2feavfd i, et 2feaafd ont une fonction commune reste posee. En effet, la presence de proteines homologues dans de nombreux contextes biochimiques et genetiques suggere leur implication dans des fonctions tres diverses dont la plupart restent a elucider.


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  • Détails : 213 p.
  • Annexes : 153 ref.

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