Microscopie de fluorescence resolue en temps pour l'etude de la diffusion de molecules dans la cuticule des feuilles

• Auteur / Autrice : NATHALIE COSTE
• Direction : ROBERT RANSU
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1999
• Etablissement(s) : Cachan, Ecole normale supérieure

Résumé

Les parties aeriennes de la plante sont protegees par une membrane lipophile, appelee cuticule, et consideree comme la premiere barriere a la penetration foliaire. L'efficacite de la penetration cuticulaire est un facteur determinant de l'activite et de la selectivite des herbicides. L'etude du transport de substances au travers de cette membrane est abordee par microscopie de fluorescence resolue en temps. Le microscope est rendu confocal pour permettre la mesure locale de la fluorescence emise par les fluorophores qui ont diffuse dans la membrane. Nous avons installe une cale piezo-electrique dans le microscope pour permettre le microdeplacement pilote du point d'observation. La profondeur de champ est mesuree egale a 0,5 m. Une excitation biphotonique est mise en place, cependant elle ne permet pas d'ameliorer cette performance. A l'issu du developpement instrumental, l'outil est teste sur un echantillon modele constitue d'un sol-gel dope et d'un film fin d'une solution de microspheres de latex fluorescentes. La mesure de l'intensite retrodiffusee permet de situer les interfaces de l'echantillon, celle en fluorescence fournit l'epaisseur des strates. L'analyse des declins couplee a celle des spectres de fluorescence permet l'identification des especes et met en evidence la diffusion des microspheres dans le film sol-gel. Cet instrument est utilise pour suivre le transport de sondes fluorescentes a l'interieur d'echantillons modeles de la cuticule des feuilles. Le profil de diffusion de la rhodamine b dans l'epaisseur d'un film de cire de carnauba est enregistre. L'espece qui diffuse a une duree de vie courte (0,2 ns) qui pourrait etre attribuee a un dimere de rhodamine b. La cinetique de diffusion du bodipy-fl a partir d'une solution de methanol fournit le coefficient de diffusion de l'ordre de 10 1 5 m 2. S 1. Ces experiences sont reconduites sur cuticules isolees de lierre (hedera). Une nouvelle approche s'avere tres interessante puisqu'il s'agit de suivre directement la diffusion de pesticides quenchers de fluorescence. La fluorescence naturelle des cuticules isolees de buis (buxus) est progressivement eteinte au cours de la diffusion du pesticide. Nous montrons que l'ajout d'un tensioactif permet d'accelerer la penetration d'un facteur cinq.