Etude des relations structure-fonction de la lipase gastrique humaine par mutagénèse dirigée et par cristallographie

par Stéphane Canaan

Thèse de doctorat en Nutrition, aspects cellulaires et moléculaires

Sous la direction de Robert Verger.

Soutenue en 1999

à Aix-Marseille 3 .


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  • Résumé

    L'adnc de la lipase gastrique humaine (hgl) a ete exprime dans le systeme baculovirus/cellules d'insecte. La proteine est secretee en grande quantite dans le surnageant du milieu de culture avec une masse moleculaire plus faible (45kda) que la proteine native (50kda) due a une glycosylation reduite. La hgl recombinante (hglr) est purifiee en deux etapes chromatographiques en presence de 10% d'isopropanol et possede des caracteristiques biochimiques similaires a celles de la hgl native. Par mutagenese dirigee, nous avons montre que le pont disulfure (non essentiel pour l'activite enzymatique) est situe entre les cysteines 227 et 236 et que la cysteine libre (244) n'intervient pas directement dans l'activite catalytique. La modification des 4 sites potentiels de n-glycosylation n'affecte pas le comportement de l'enzyme aux interfaces. La glycosylation aurait plutot un role protecteur vis-a-vis de l'action proteolytique de la pepsine. La cristallogenese de la hglr a permis de resoudre pour la premiere fois a 3a de resolution, la structure 3d d'une lipase acide de mammifere. La proteine globulaire se decompose en plusieurs elements structuraux superposes : le corps, le cap et le lid qui rendent la triade catalytique (ser 1 5 3-asp 3 2 4-his 3 5 3) inaccessible au solvant. Le lid recouvre la serine catalytique et le cap pourrait etre le site de fixation des lipides. Les 4 sites potentiels de glycosylation sont occupes et la position proposee pour le pont disulfure a ete confirmee. La cysteine libre est trop eloignee (5a) du centre actif pour participer directement a la catalyse. Le trou de l'oxyanion est preforme et constitue des residus gln 1 5 4 et leu 6 7. La connectivite de la hgl et le cap sont analogues a ceux des carboxypeptidases a serine. La lipase lysosomale homologue a la hgl a ete modelisee et quelques mutations, conduisant a la polycorie cholesterolique, peuvent etre expliquees sur la base de ce modele.

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Informations

  • Détails : 142 p.

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  • Bibliothèque : Université d'Aix-Marseille (Marseille. Saint-Jérôme). Service commun de la documentation. Bibliothèque de sciences.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : T 2706/A-B
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