Caracterisation et marquage chimique d'un p450 detoxifiant l'herbicide diclofop chez le ble

par NATHALIE FORTHOFFER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de JEAN-PIERRE SALAUN.

Soutenue en 1998

à Strasbourg 1 .

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  • Résumé

    Le ble est naturellement resistant a de nombreux herbicides dont le diclofop-methyl (dim) et le chlorotoluron (ctu) grace a des p450s qui les metabolisent. Au cours de mon travail de these, j'ai etudie l'effet du dim et du ctu sur l'induction des p450s. Les resultats obtenus montrent que ces xenobiotiques induisent les p450s qui les metabolisent mais aussi ceux dont ils ne sont pas substrats. En cela, le dim et le ctu ont des proprietes comparables aux antidotes. De plus, le p450 qui metabolise le diclofop (dih) a egalement pour substrat l'acide laurique (lau) ainsi appele lah. Un autre de mes objectifs etait de purifier ce p450, d'obtenir des sequences qui permettront de cloner son gene afin d'etudier, au niveau moleculaire, le mecanisme de regulation de son expression et sa specificite de substrat. Or la purification par des methodes classiques est tres ardue car les p450s sont des proteines hydrophobes et faiblement representees au niveau des proteines microsomiques. Pour contourner ce probleme, nous avons marque physiquement la lah avec un inhibiteur irreversible, analogue acetylenique de l'acide laurique, le 10-ddya, radioactif. Les experiences realisees in vitro (10-ddya) et in vivo (analogues du 10-ddya modifies pour ne pas etre degrades par -oxydation) ont montre que ces composes inactivent selectivement les activites laurate et diclofop-hydroxylases. L'inactivation de ces activites s'accompagne du marquage radioactif d'une zone proteique de 57 kda, sur sds-page. Le marquage de la lah dans les microsomes nous a permis de suivre l'elution de cette proteine sur colonne hydrophobe. Par contre, apres electroelution en gel preparatif de poyacrylamide, on ne retrouve plus de radioactivite associee a la lah. En fait, l'inactivation de la lah resulterait principalement de l'alkylation d'un des azotes de l'heme et ce dernier, radiomarque, en presence d'agents reducteurs, se dissocie de l'apoproteine. Enfin, le fort enrichissement en proteines d'environ 57 kda apres electroelution nous a permis d'obtenir une sequence peptidique, portant la signature des p450s. Cette sequence servira a l'isolement de l'adnc puis a son clonage et son expression afin de caracteriser l'enzyme comme etant ou non la lah.


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Informations

  • Détails : 84 P.
  • Annexes : 126 REF.

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