Etude structurale et fonctionnelle de l'extremite n-terminale de la sous-unite gyrb de l'adn gyrase d'escherichia coli

par LAURENT BRINO

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Pierre Oudet.

Soutenue en 1998

à Strasbourg 1 .

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  • Résumé

    L'adn gyrase est la topoisomerase bacterienne qui catalyse le superenroulement negatif, la catenation/decatenation, le nouement/denouement de molecules plasmidiques in vitro. Tous ces processus necessitent la liaison et l'hydrolyse de l'atp. In vivo, l'adn gyrase est impliquee dans la replication, la reparation, la recombinaison et la transcription de l'adn. La sous-unite gyrb de l'enzyme d'e. Coli est composee d'un domaine n-terminal de 43 kda contenant le site atpasique et un domaine de 47 kda implique dans l'association de la sous-unite gyrb avec la sous-unite gyra au sein du tetramere actif a2b2. De precedentes etudes cristallographiques ont signale que le residu y5 de la sous-unite gyrb interagit avec le nucleotide lie a une autre sous-unite, indiquant que la dimerisation des sous-unite gyrb contribue a la formation des sites de liaison de l'atp. Dans ce travail, nous desirions caracteriser les acides amines impliques dans la dimerisation des sous-unites gyrb, et ainsi dans leur fonction. Dans la premiere partie de ce travail, nous avons developpe un test fonctionnel in vivo pour demontrer l'implication du residu y5 dans la fonction de la sous-unite gyrb. Les etudes realisees in vitro ont ensuite permis de demontrer que ce residu est crucial pour les activites atp dependantes de l'adn gyrase. Dans la seconde partie de ce travail, nous avons cristallise et resolu la structure d'un fragment mutant y5s de la sous-unite gyrb en presence d'adpnp (sous forme non complexe au mg). Des etudes biochimiques ont ete realisees sur des fragments mutants y5s, y5f, i10g and d1-14 (deletion du bras n-terminal). A la lueur des resultats biochimiques et structuraux, nous avons demontre la contribution positive de la dimerisation sur la stabilisation des sites de liaison de l'atp, et en particulier d'un petit canal par lequel les molecules d'eau transitent pour acceder au groupe phosphate cible a l'interieur de la poche catalytique. La superposition de la structure sauvage sur notre structure ne contenant pas d'ion mg a aussi permis de reveler le role joue par ce cation divalent pour l'orientation des groupes phosphates dans la poche catalytique. Une autre comparaison de notre structure avec la structure d'un fragment gyrb complexe avec l'antibiotique novobiocine permis d'indiquer la presence de residus clefs de l'interface de dimerisation des sous-unites gyrb dans le site de liaison de cette drogue, expliquant ainsi la stabilisation de la forme monomere du domaine liant l'atp induite par cette drogue.


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Informations

  • Détails : 162 P.
  • Annexes : 166 REF.

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