Clonage d'un gene codant pour une alpha-amylase a partir de l'archaebacterie thermophile thermococcus hydrothermalis al662 (collection ifremer-brest). Etude des parentes phylogenetiques avec les autres alpha-amylases

par Emmanuel Lévêque

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Abdel Belarbi et de Bernard Haye.

Soutenue en 1998

à Reims .

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  • Résumé

    Nous avons cherche a cloner le gene codant pour l'-amylase de l'archaebacterie thermococcus hydrothermalis chez escherichia coli. Pour cela, des banques genomiques ont ete construites a partir de l'adn de la souche t. Hydrothermalis et criblees a l'aide de techniques biochimiques et microbiologiques. Exception faite d'un clone, les activites exprimees par les genes clones n'ont pu etre maintenues. De plus, cette colonie etait porteuse au niveau du plasmide qu'elle renfermait d'un transposon et apparemment le gene codant l'activite amylasique clone avait ete insere dans le genome de la bacterie receptrice. Il nous a donc fallu changer notre approche experimentale. Un amplifiat de 221 pb a alors ete construit par pcr a partir de l'adn genomique de t. Hydrothermalis puis clone et marque. Il a ensuite ete utilise pour isoler le gene recherche par la technique de southern-blot. Ainsi, un fragment de 4 kpb a ete isole et clone. Le gene recherche a ete localise a l'interieur de ce fragment, puis sous-clone apres construction du plasmide p662el100. L'insert de ce plasmide (2,7 kpb) a alors ete sequence. Le gene de l'-amylase de t. Hydrothermalis est long de 1374 pb. Il code pour une enzyme de 457 acides amines fortement homologue aux autres -amylases issues de thermococcales connues. En amont et en aval de l'orf ont ete retrouvees des sequences promotrices et terminatrices typiques des archaebacteries. Apres production de l'enzyme recombinante (thamy), ses proprietes physico-chimiques ont ete recherchees. Ces etudes ont montre qu'elle avait conserve ses proprietes initiales (temperature optimale : 75-85c ; ph optimal : 5,0-5,5) et que c'etait une enzyme liquefiante. L'effet de differents ions metalliques sur l'activite de thamy a egalement ete etudie. Une etude des relations evolutives entre les -amylases a egalement ete realisee. Cette etude a montre que les -amylases issues de thermococcales etaient phylogenetiquement tres proches des enzymes issues de plantes.


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Informations

  • Détails : 242 P.
  • Annexes : 525 REF.

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  • Bibliothèque : Université de Reims Champagne-Ardenne. Bibliothèque universitaire. Bibliothèque Moulin de la Housse.
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