Analyse fonctionnelle des récepteurs murins de la somatostatine

par Dragan Djordjijevic

Thèse de doctorat en Endocrinologie et interactions cellulaires

Sous la direction de Danielle Gourdji.

Soutenue en 1998

à Paris 11 , en partenariat avec Université de Paris-Sud. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne) (autre partenaire) .

Le président du jury était Bernard Rossignol.

Le jury était composé de Danielle Gourdji, Bernard Rossignol, Dominique Durand, Philippe Vernier, Marie-Christine Tonon, Claude Cordon.

Les rapporteurs étaient Dominique Durand, Philippe Vernier.

mots clés

• RT-PCR quantitative
• Traduction in vitro
• Somatropine
• Protéines G
• Buvardage de western
• Traduction génétique
• Stratégies antisens
• Récepteurs couplés aux protéines G
• Récepteur somatostatine
• Hormone de croissance

Résumé

La somatostatine (SRIH), un tétradécapeptide largement distribué dans le système nerveux central et les organes périphériques, est impliquée dans plusieurs fonctions neuronales, endocriniennes, gastro-intestinales et immunitaires. Cinq sous-types de récepteurs de la SRIH ont été récemment clonés (sst1 à sst5) ; ils appartiennent à la superfamille des récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G. Dans l'hypophyse, la SRIH inhibe la sécrétion d’hormone de croissance (GH) ainsi que celle de prolactine (PRL), mais seulement en présence d'œstradiol (E2). Le but de nos travaux était de déterminer quels isotypes étaient impliqués dans ces effets. Nous avons donc caractérisé le profil pharmacologique de la réponse à SRIH dans les deux conditions et montré que l'inhibition de la sécrétion de GH comme de PRL s'explique en majeure part par la mise en jeu de l'isotype sst2. En parallèle, nous avons montré par une technique de RT-PCR quantitative l'expression majoritaire de sst2 et sst3 dans des cellules adénohypophysaires de rat cultivées dans les mêmes conditions. L'addition de E2 surexprime sélectivement ces deux isotypes. Dans un autre modèle, les cultures primaires de cellules neuronales et gliales d'hypothalamus de souris, nous démontrons une expression majoritaire de sst1 et sst2 dans les neurones, alors que l'isotype sst2 prédomine dans les cellules gliales. Dans la dernière partie de la thèse, nous avons tenté d'inhiber l'expression de sst2 et sst3, ainsi que celle de différentes sous- unités de protéines Gα, par une stratégie antisens. Nous avons optimisé les conditions d'application des oligonucléotides (ODN) : choix des séquences, de la nature des ODN (natifs, phosphorothioate) et des vecteurs (nanoparticules, lipofectine), concentration, temps d'application. La pénétration et la stabilité des ODN dans la cellule, leur effet sur la traduction in vitro et l'accumulation des protéines correspondantes (par immuno-blot) ont été mesurés, ainsi que les réponses adénylylcyclasique et sécrétoire de la cellule. Le meilleur rapport inhibition de traduction / concentration a été obtenu avec les nanoparticules ; mais même dans les conditions optimales du point de vue de la traduction, n'a malheureusement pas été possible d'inhiber la réponse sécrétoire dans des conditions suffisamment reproductibles pour des concentrations d'ODN compatibles avec l'absence d'effet non spécifique.

Titre traduit

Functional analysis of murine somatostatin receptors

Résumé

Somatostatin (SRIH), a tetradecapeptid largely present in the central nervous system and peripheral organs, is implicated in many neuronal, endocrine, gastro-intestinal and immune functions. Five subtypes of recently cloned SRIH receptors belong to the superfamily of receptors with 7 transmembrane domains, coupled with G proteins. In the pituitary, SRIH inhibits the secretion of growth hormone (GH), and in the presence of estradiol (E2), that of prolactin (PRL). The goal of our work was to determine which subtypes were implicated in these effects. We thus characterized the pharmacological profile of SRIH response with and without E2 and showed that SRIH inhibition of GH and PRL secretion is mainly explained by the involvement of the sst2 subtype. In parallel, we showed by use of quantitative RT-PCR the predominant expression of sst2 and sst3 in rat anterior pituitary cells cultivated in the same conditions. The addition of E2 selectively increases the expression of these two subtypes. In another model, primary cultures of neuronal and glial cells of mouse hypothalami, we demonstrated a predominant expression of sstl and sst2 in neurons, while sst2 subtype is predominant in glial cells. Finally, we tried to inhibit the expression of sst2 and sst3, as well as that of different subunits of Gα proteins by the use of antisense strategy. We optimized the conditions of oligonucleotide (ODN) application: choice of sequences, nature of ODN (native, phosphorothioate) and vectors (nanoparticles, lipofectin), concentration and time of incubation. The penetration and stability of ODN in the cell, their effect in vitro translational conditions and the level of the expression of corresponding proteins (by western-blot) were measured, as well as the adenylate cyclase activity and secretion. The best translationalinhibition/concentration ratio was obtained with nanoparticles; but even in optimal conditions as concerns translation, it was unfortunately not possible to inhibit secretion in sufficiently reproducible conditions without non-specifie effects.