Etude de la tolerance d'une proteine aux insertions polypeptidiques : application a la construction de proteines chimeres

par BRUNO COLLINET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Philippe Minard.

Soutenue en 1998

à Paris 11 .

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  • Résumé

    La technique de mutagenese dirigee par insertion d'acides amines a ete utilisee sur la phosphoglycerate kinase (pgk) de levure afin d'etudier le role des boucles dans le repliement et la stabilite des proteines. Des boucles de la pgk ont ete selectionnees dans lesquelles ont ete inseres des segments peptidiques (1 a 16 residus), comprenant majoritairement des glycines ou des threonines. 12 mutants ont ete construits dont certains ont fait l'objet d'une etude approfondie : mesure d'activite, modifications chimique, etude de la denaturation/renaturation par dichroisme circulaire, microcalorimetrie differentielle (dsc). Les principales conclusions de ces travaux montrent que l'insertion d'un motif constitue de glycines semble plus destabilisateur d'un motif contenant des threonines. L'effet destabilisateur majoritaire apparait des l'insertion des premiers residus et n'est pas proportionnel a la longueur du motif insere. Quelques differences ont ete observees selon la topologie des boucles : les insertions dans les boucles se traduisent essentiellement par un ralentissement du processus de renaturation alors que dans les boucles l'insertion se traduit par une destabilisation de la proteine. L'insertion de la -lactamase (bla, 263 residus) et/ou de la dihydrofolate reductase (dhfr, 159 residus) a egalement ete entreprise dans les boucles de la pgk. Parmi les 8 proteines chimeres obtenues, possedant toutes une activite pgk, 7 ont ete etudiees et possedent egalement l'activite de l'objet insere (bla ou dhfr). Les principaux effets se traduisent par une reversibilite partielle de la renaturation, un ralentissement de la renaturation et une destabilisation de la proteine hote et de la proteine inseree. Des couplages fonctionnels entre les deux entites formant la chimere ont egalement ete mis en evidence. Les consequences de telles constructions (applications eventuelles, etude du repliement des proteines, evolution des proteines) sont discutees.


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  • Détails : 179 P.
  • Annexes : 336 REF.

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  • Disponible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-013813
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