Caracterisation structurale du cytochrome b#5#5#8, composant membranaire de la nadph oxydase de neutrophiles humains

par CELINE DER MARDIROSSIAN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Florence Lederer.

Soutenue en 1998

à Paris 11 .

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  • Résumé

    Les neutrophiles ont un role primordial dans la defense immunitaire non specifique grace a un enzyme, la nadph oxydase qui necessite l'assemblage d'un constituant membranaire, le cytochrome b#5#5#8, et des facteurs cytosoliques pour etre actif. La chaine du cytochrome porterait le site de fixation du fad et du nadph. Neanmoins, l'hemoproteine purifie en presence de detergent n'a jamais de flavine. Notre premier objectif consiste a essayer de solubiliser et de purifier le cytochrome b#5#5#8 sans perte de flavine avec un nouveau compose perfluoroalkyle (f8c2pc). Il extrait autant de proteines membranaires dans un surnageant a 100 000 g que l'octyl glucoside. La flavine est encore liee a la membrane dans l'extrait en f8c2pc a un rapport fad/heme de 1 et une activite oxydase est obtenue sans addition de fad exogene meme apres une dialyse, contrairement aux extraits en octyl glucoside. Le f8c2pc semble etre un interessant agent solubilisant des proteines membranaires. Toutefois, differentes etudes, le cryodecapage en microscopie electronique, la centrifugation a plus grande vitesse de l'extrait a 100 000 g, les tests de solubilisation sur des vesicules du reticulum sarcoplasmique, indiquent que le f8c2pc ne solubilise pas reellement les proteines. Notre second objectif est d'essayer de determiner le nombre d'hemes et la stchiometrie en sous-unites du cytochrome b#5#5#8. Il nous faut une proteine pure, une masse proteique correcte et un coefficient d'extinction molaire exact. Nous utilisons des methodes analytiques telles que l'analyse d'acides amines, pour une determination rigoureuse de proteine, le pyridine hemochromogene, pour la quantification de l'heme, et le sequencage de l'extremite n terminale de la proteine, pour la stchiometrie en sous-unites. Ces methodes ont ete mises au point avec le flavocytochrome b#2 tres bien caracterisee. Les differentes resines testees pour une purification optimale ne permettent pas d'obtenir une proteine pure. Neanmoins, la purete de l'echantillon est suffisante pour determiner une stchiometrie en sous-unites du cytochrome de 1/1. Prenant en compte le degre de purete final, nous estimons a 1 le rapport heme/molecule de cytochrome. En depit de tous les tests, il est difficile d'obtenir une proteine assez pure pour ce travail. Par consequent, cette valeur doit etre confirmee.


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Informations

  • Détails : 204 P.
  • Annexes : 265 REF.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
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  • Cote : TH2014-013684
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