Etude de la structure et de la fonction de la protoporphyrinogene oxydase, cible moleculaire des herbicides de type diphenyl-ether

par SYLVAIN ARNOULD

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean-Michel Camadro.

Soutenue en 1998

à Paris 7 .

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  • Résumé

    La protoporphyrinogene oxydase, enzyme de la membrane interne des mitochondries, est la cible des herbicides de type dpe. La phytotoxicite de ces composes est induite par l'accumulation dans les cellules traitees de protoporphyrine ix, le produit de la reaction catalysee par l'enzyme. Cette accumulation a aussi ete decrite chez les malades atteints de porphyrie variegate. Nous avons dans un premier temps caracterise l'inhibition de l'enzyme par le dpi et ses derives. Nous avons pu definir un mecanisme d'inhibition de type fixation lente ou slow-binding avec une competition entre les derives diphenyleneiodonium et l'oxygene au cours de l'etape de reoxydation de la flavine. Nous avons defini les parametres de l'inhibition et presente une nouvelle methode de determination de l'affinite de la protoporphyrinogene oxydase pour l'oxygene. Nous avons alors generalise cette methodologie developpee a d'autres flavoproteines de type oxydase ayant l'oxygene comme substrat et ainsi defini un mecanisme general d'inhibition de ces flavoproteines et isole le complexe inhibiteur-flavine libre. Nous avons, mis au point des systemes efficaces de production de la protoporphyrinogene oxydase chez la levure et le colibacille. Nous avons pu determiner, par mesure de l'elipsite de la proteine en dichroisme circulaire, la composition en structures secondaires. Nous avons pu mesurer la stabilite thermique de l'enzyme et l'energie d'activation de sa denaturation. Nous avons mesure une augmentation de la stabilite de la protoporphyrinogene oxydase en presence des inhibiteurs et des effecteurs. Nous avons pu caracteriser deux domaines fonctionnels structuraux tres stables de la protoporphyrinogene oxydase : le domaine n- terminal portant le site d'interaction du cofacteur et potentiellement le site d'ancrage a la membrane, et le domaine c- terminal portant le site catalytique. Nous avons mis en evidence une seconde modification post-traductionnelle de la protoporphyrinogene oxydase, l'acylation. Nous avons pu montrer l'acylation de la proteine par l'acide palmitique et / ou l'acide palmitoleique in vitro et in vivo. Outre le role d'ancrage a la membrane frequemment evoque, nous avons pu mettre en evidence un role fonctionnel de l'acylation consistant en la stabilisation de la structure de la proteine. Nous avons commence la cristallogenese de la proteine de levure et nous avons obtenu des cristaux de la protoporphyrinogene oxydase dpe. Nous cherchons actuellement a ameliorer les conditions de cristallisation afin d'obtenir des cristaux de taille suffisante, puis determiner si ces cristaux diffractent afin d'en determiner les phases.


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Informations

  • Détails : 200 p.
  • Annexes : 218 ref.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • Accessible pour le PEB
  • Cote : TS1998
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