Reconnaissance moleculaire proteine - proteine : etude cristallographique de la barnase, de barstar et de mutants compensatoires de l'interface

par CAROLE MARTIN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Yves Mauguen.

Soutenue en 1998

à Paris 6 .

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  • Résumé

    Le complexe entre la barnase, une ribonuclease extracellulaire produite par bacillus amyloliquefaciens, et barstar, son inhibiteur intracellulaire naturel, est un systeme modele largement utilise pour l'etude de la reconnaissance proteine - proteine. La structure du complexe barnase - barstar etant connue, nous avons entrepris l'affinement a haute resolution de la structure de l'enzyme libre et l'etude cristallographique de l'inhibiteur isole. La comparaison des structures de l'enzyme et de l'inhibiteur, sous forme isolee et complexee, a permis de caracteriser les modifications structurales, extremement localisees et de faible amplitude, lors de la formation du complexe. Les molecules d'eau presentes a l'interface preexistent dans les structures libres ; elles contribuent ainsi favorablement a l'association. Le complexe barnase - barstar a ete utilise pour analyser les mutations compensatoires de l'interface. Une approche originale a ete l'isolement in vivo de mutants de barstar capables de compenser la perte dans l'energie d'interaction causee par une mutation de la barnase (h102k), ou l'histidine catalytique est mutee en lysine. Ce mutant de barnase possede une activite ribonucleasique residuelle non inhibee correctement par le barstar natif. Sur les 6 residus de barstar en contact avec l'his102 dans le complexe natif qui ont ete soumis a la mutagenese dirigee aleatoire, deux simples mutants, (y29p) et (y30w), entrainent une bonne protection contre l'activite ribonucleasique de la barnase h102k, le barstar double mutant (y29d, y30w) s'avere etre le meilleur inhibiteur. Afin de correler ces variations d'affinite aux modifications conformationnelles dues aux mutations, nous avons entrepris l'etude cristallographique de ces mutants ainsi que de leurs complexes. Il apparait que les mutants ne subissent pas de modifications structurales importantes du fait des mutations. La mutation de l'histidine catalytique en lysine introduit une charge non compensee enfouie a l'interface ce qui diminue la constante d'association d'un facteur 10 9. Les mutations compensatoires a l'interface barnase - barstar semblent agir essentiellement en ouvrant la poche ou se trouve la chaine laterale 102 vers l'exterieur, permettant sa solvatation et une compensation partielle de sa charge.


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Informations

  • Détails : 149 p.
  • Annexes : 184 ref.

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  • Bibliothèque : Université Pierre et Marie Curie. Bibliothèque Universitaire Pierre et Marie Curie. Section Biologie-Chimie-Physique Recherche.
  • Disponible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : PMC RT P6 1998
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