Caractérisation de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase (GAPDH) phosphorylante isolée d'une archae et étude comparative avec les GAPDH isolées de bactéries

par François Talfournier

Thèse de doctorat en Enzymologie moléculaire

Sous la direction de Guy Branlant.

Soutenue en 1998

à Nancy 1 .


  • Résumé

    Les propriétés enzymatiques de la Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) phosphorylant' d'une archae méthanogène, Methanothennus fervidus, ont été caractérisées en vue de mieux définir le lien phylogénétique pouvant exister entre les GAPDH isolées de bactéries et d'eucaryotes d'une part, et d'archae d'autre part. En effet, alors que le taux d'identité de séquence entre les GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique est supérieur à 40%, il n'est que de 15% avec la quasi-totalité des GAPDH isolées d'archae. L'étude des propriétés catalytiques du type sauvage de la GAPDH de M. Fervidus a montré que, dans le sens oxydation de la réaction, l'étape de phosphorolyse semble limitante à la fois à pH acide (5,4) et à pH basique (8,5), bien que la vitesse de relargage du cofacteur réduit contribue aussi fortement à la vitesse globale de la réaction. Dans le sens réduction, les étapes limitantes sont identiques à celles décrites pour les GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique à savoir, le relargage du G3P à pH acide et un changement conformationnel lié à la fixation du cofacteur réduit à- pH basique. Un modèle de structure tridimensionnelle de la GAPDH de M. Fervidus a été élaboré, en collaboration avec l'équipe du Dr J-P Mornon, sur la base d'alignements HCA en utilisant les structures quaternaires connues à haute résolution des GAPDH d'E. Coli et de B. Stearothennophilus. Le modèle structural présente une topologie de repliement globalement identique à celle des GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique, notamment au niveau du domaine du cofacteur où un repliement de Rossmann est retrouvé. L'étude des mutants K32D, K32E et K32A a permis de montrer le rôle déterminant de la Lysine 32 dans la fixation préférentielle du NADP à la GAPDH de M. Fervidus, alors que l'Asp32 est essentiel à la fixation préférentielle du NAD aux GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique. Les facteurs structuraux impliqués dans la stabilisation de la conformation syn de la partie nicotinamide n'ont pu être identifiés. Cependant, l'intervention d'un résidu Asn, équivalent à l'Asn313 des GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique, a pu être exclue. La Cys149 essentielle présente un pKapp de 6,2 et une réactivité chimique compatibles avec l'activité enzymatique observée à pH physiologique, et comparables à ceux des GAPDH bactériennes et eucaryotiques. Cependant, contrairement à ces dernières, la Cys149 n'est pas impliquée dans une interaction de type paire d'ions avec une Histidine (His176). La nature de l'environnement protéique responsable de la réactivité de la Cys149 des GAPDH d'archae reste à définir. Nos études excluent toutefois l'implication d'un acide aminé unique. La nature de la base vraisemblablement impliquée dans le transfert de l'hydrure vers le cofacteur reste également à définir, mais n'est pas l'His176 comme nous l'avons démontré pour les GAPDH bactériennes. Le rôle des Arginines invariantes en position 176 et 177 a été étudié par mutagenèse dirigée. Les mutants RI76N et RI77N présentent un kcat diminué respectivement d'un facteur 160 et d'un facteur 10, l'étape d’acylation n'étant pas limitante. De plus, un fort effet coopératif cinétique a été mis en évidence pour le phosphate dans le mutant RI77N, ce qui suggère que l'étape de phosphorolyse est limitante et que cette Arginine pourrait participer au site de fixation du phosphate inorganique. Un tel résultat suggère que les sites de reconnaissance anioniques diffèrent de ceux rencontrés dans les GAPDH d'origine bactérienne et eucaryotique. L'ensemble de nos résultats suggère fortement que les activités GAPDHase présentes d'une part dans les archae et d'autre part dans les bactéries et les eucaryotes ne dérivent pas d'un ancêtre commun mais résultent plutôt d'une évolution structurale convergente vers la fonction GAPDH.


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  • Détails : 1 vol. (164 p.)
  • Annexes : 213 ref.

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