Purification et caractérisation de la glutamate déshydrogénase à NAD chez le basidiomycète ectomycorhizien Laccaria bicolor : régulation de son activité chez le champignon en culture pure et dans deux associations ectomycorhiziennes

par Agathe Garnier-Petit

Thèse de doctorat en Biologie végétale et forestière

Sous la direction de Bernard Botton.

Soutenue en 1998

à Nancy 1 .


  • Résumé

    La GDH à NAD du champignon ectomycorhizien Laccaria bicolor a été purifiée à homogénéité électrophorétique. Le protocole de purification comporte trois étapes simples, une précipitation au sulfate d'ammonium, une chromatographie échangeuse d'anions et une filtration moléculaire. La GDH à NAD a été purifiée 410 fois avec un rendement de 40%. La masse moléculaire de l'enzyme native est de 470 kDa, celle des sous-unités de 116 kDa suggérant que la GDH à NAD est un tétramère. L’enzyme est spécifique pour le NAD(H). Les pH optimums sont de 7,4 et de 8,8 pour les réactions d'amination et de désamination respectivement. L’addition de sulfate d'ammonium permet une bonne stabilité de l'activité enzymatique. La GDH à NAD est stimulée par le calcium, le magnésium, fortement inhibée par le cuivre et légèrement par les nucléotides AMP, ADP et ATP. Les constantes d'affinité pour le NAD, NADH, α-cétoglutarate et l'ammonium sont de 282 µM, 89 µM, 1,35 mM et 37 mM respectivement. Le rôle physiologique de la GDH à NAD a été étudié chez Laccaria bicolor cultive sur différentes sources azotées. Une régulation différente des deux GDHS est mise en évidence sur milieu nitrate et ammonium, conséquence de leur fonction métabolique distincte. La GDH à NAD et la GS ont un rôle assimilateur tandis que la GDH à NAD possède une fonction déprédative. La source et la concentration en azote régule fortement la GS et la GDH à NAD. Ces enzymes sont réprimées par les fortes teneurs en azote, en relation avec la teneur en ammonium intracellulaire. La GDH à NAD est nettement moins influencée par le statut azoté cellulaire. L’effet des sources carbonées sur les activités GDH à NAD et GDH à NADP caractérise une simulation de ces deux enzymes sur un milieu contenant du succinate et du fumarate. La GDH à NAD est plus fortement stimulée. Ceci suggère un contrôle de ces enzymes par le circuit carboné. L’étude de l’expression de la GDH à NAD dans deux ectomycorhizes montre une répression de l’isoforme fongique tandis que l’isoforme racinaire est conservée. Dans les ectomycorhizes de Douglas / Laccaria bicolor, la GDH à NADP fongique est active tandis que dans l’association Eucalyptus globulus / Laccaria bicolor, elle est réprimée.


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  • Détails : 1 vol. (179 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : 237 références

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