Etude fonctionnelle et structurale de l'isocitrate deshydrogénase kinase-phosphatase d'Escherichia coli

par Christelle Oudot-Delacoux

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Alain-Jean Cozzone.

Soutenue en 1998

à Lyon 1 .

Le président du jury était Alain-Jean Cozzone.


  • Résumé

    L'isocitrate deshydrogenase kinase/phosphatase (idhk/p) d'escherichia coli est une enzyme cle du metabolisme des bacteries cultivees sur acetate comme seule source de carbone. Dans cette situation physiologique particuliere l'idhk/p, enzyme homodimerique appartenant a la famille des serine/threonine proteine-kinases, inactive par phosphorylation son substrat l'isocitrate deshydrogenase, bloquant ainsi le cycle de krebs qui est alors relaye par le cycle glyoxylique. Nous nous sommes interesses, d'une part, a la caracterisation structurale et fonctionnelle du site actif de l'idhk/p et, d'autre part, au mecanisme de dimerisation de cette proteine. Dans un premier temps, une approche par marquage d'affinite, en utilisant notamment un analogue de l'atp, le 5-p-fluorosulfonylbenzoyl adenosine (fsba), a montre que celui-ci inactive l'idhk/p en catalysant la formation d'un pont disulfure intramoleculaire entre les cysteines 356 et 523. L'etude des mutants cys356ser et cys523ser a montre que la cysteine 356 est la cible primaire du fsba et que le mutant cys523ser est inhibe par le fsba par formation d'un pont disulfure cys356-cys480. L'ensemble de ces resultats indique que la cysteine 356 est situee a proximite ou dans le centre actif, et que les 3 cysteines, 356, 480 et 523 sont tres proches l'une de l'autre dans la structure tridimensionnelle de l'idhk/p. Dans un deuxieme temps, l'alignement de la sequence primaire de l'idhk/p avec celle d'autres proteine-kinases eucaryotiques, au niveau des domaines catalytiques conserves, a permis de predire la triade catalytique au sein de cette enzyme. Ainsi nous avons montre que le residu asp371 de l'idhk/p est probablement un residu catalytique et que les residus asn377 et asp403 sont impliques dans la fixation du magnesium par l'enzyme. Enfin, l'utilisation d'agents oxydant les cysteines a mis en evidence la presence de la cysteine 67 a l'interface entre les deux monomeres de l'idhk/p, cette cysteine etant la seule, parmi les 8 cysteines de l'idhk/p, a etre impliquee dans la dimerisation de l'enzyme via un pont disulfure.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (147 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 122-147

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  • Bibliothèque : Université Claude Bernard (Villeurbanne, Rhône). Service commun de la documentation. BU Sciences.
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