Essai de surproduction du facteur d'élongation eEF-2 dans divers systèmes hétérologues : étude de l'interaction in vitro de eEF-2 avec les protéines ribosomiques acides P1 et P2

par Patricia Bargis-Surgey

Thèse de doctorat en Sciences. Biochimie

Sous la direction de Jean-Paul Reboud.

Soutenue en 1998

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Jean-Paul Reboud.


  • Résumé

    Au cours de l'etape d'elongation de la synthese proteique, le facteur d'elongation eucaryote eef-2 catalyse la translocation du peptidyl-arnt du site a au site p du ribosome avec hydrolyse du gtp et le mouvement du ribosome le long de l'arnm. Dans ce travail, l'etude des relations structure-fonction de eef-2 par mutagenese dirigee a ete envisagee. Nous avons isole puis clone l'adnc de eef-2 de foie de rat dans divers systemes bacteriens, puis dans la levure pichia pastoris pour obtenir eef-2 recombinant. Malheureusement aucun systeme n'a conduit a l'obtention de eef-2 sous forme soluble. Grace a l'introduction au laboratoire de la biologie moleculaire, les proteines ribosomiques p1 et p2 ont ete surproduites dans l'equipe. Des experiences de reconstitutions de ribosomes actifs, apres addition des proteines recombinantes p1 et p2 a des particules partiellement deproteinisees inactives, ont montre que ces proteines doivent etre toutes les deux presentes et que p2 doit etre sous forme phosphorylee pour restaurer les activites dependantes de eef-2. Une etude mettant a profit la fluorescence des tryptophanes de eef-2 a permis de mettre en evidence une attenuation de la fluorescence de eef-2 en presence de p2 phosphorylee suggerant que la forme phosphorylee de p2 interagit avec ce facteur. Nous avons alors entrepris dans ce travail, l'etude in vitro de l'interaction de eef-2 avec les proteines ribosomiques p1 et p2 par deux techniques, la resonance plasmonique de surface (biacore) pour l'etude cinetique de cette interaction, et la proteolyse menagee par l'endoproteinase glu-c (v8) du complexe eef-2 avec p1 ou p2, pour etudier d'eventuelles modifications de l'accessibilite de ces proteines a la protease v8. Les resultats obtenus par la technique du biacore mettent en evidence l'existence d'une interaction de eef-2 avec non seulement p2 mais aussi p1. Ils montrent que l'affinite de p1 pour eef-2 est superieure (k d=3,8 10 - 8 m) a celle de p2 (k d=2,2 10 - 6 m). La phosphorylation de p2 entraine une legere augmentation (2 a 3 fois) de son affinite pour eef-2, celle-ci augmentant avec le degre de phosphorylation de p2. L'utilisation d'un mutant de p2 : p2s105d, suggere que l'effet de la phosphorylation est du a l'apport de charges negatives supplementaires. La phosphorylation de p1 entraine egalement une legere augmentation (environ 4 fois) de son affinite pour eef-2. Les experiences de proteolyse menagee montrent une augmentation de l'accessibilite de eef-2 a la protease v8 en presence de p1 ou p2. Cet effet est observe en absence comme en presence de nucleotides guanyliques. La phosphorylation de p1 et p2 entraine quant a elle peu de changements sur la cinetique de digestion. La meme experience faite sur eef-2 seul en presence de nucleotides guanyliques montre que le gtp protege eef-2 de la proteolyse alors que le gdp exerce l'effet inverse. Le changement conformationnel de eef-2 lors de l'interaction avec p1 et p2 est donc similaire a celui observe dans le complexe eef-2-gdp. Si l'on rapproche les resultats des experiences de reconstitutions decrites ci-dessus avec l'ensemble de ces resultats, nous pouvons emettre des hypotheses quant au role de chacune de ces proteines ribosomiques. Les reconstitutions ont montre que seule la phosphorylation etait indispensable mais que p1 et p2 etaient toutes deux requises pour l'activite de eef-2. Les resultats presentes ici montrent que p1 et p2 interagissent avec eef-2 en provoquant un changement conformationnel de ce facteur et que p1 a une affinite environ 50 fois superieure a p2. Ainsi ces resultats suggerent que p1 et p2 pourraient avoir des roles differents dans la fixation et l'activite de eef-2. Des mutants de p2 tronques en c-terminal ont ete construits pour mieux localiser le site d'interaction avec eef-2. Ces mutants ont ete testes par la technique du biacore et la proteolyse menagee par la v8. Les resultats obtenus sont en accord avec l'hypothese d'une interaction de la partie c-terminale des proteines p avec eef-2.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (194 p.)
  • Annexes : Bibliogr. p. 173-191

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