Analyse d'événements de recombinaisons induits par la création d'une structure secondaire sur un ARN rétroviral et applications pour l'élaboration de vecteurs rétroviraux

par Pascal Faraut

Thèse de doctorat en Sciences. Différenciation, génétique et immunologie

Sous la direction de Gérard Verdier.

Soutenue en 1998

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Gérard Verdier.


  • Résumé

    Les vecteurs retroviraux offrent des possibilites d'utilisation en recherches fondamentale et appliquee. Dans le cadre d'un transfert de genes in vivo, les stocks vecteurs viraux doivent presenter un titre eleve en particules et ne pas contenir de forme virale parasite. De plus ces vecteurs une fois integres ne doivent pas pouvoir ressortir de la cellule dans laquelle ils ont ete introduits. Il faut donc pouvoir perdre au cours de la replication du genome retroviral un element necessaire a la production du stock viral mais inutile par la suite dans la cellule cible. Il est rapporte que de petites structures secondaires peuvent etre deletees lors de la transcription inverse. Nous avons utilise cette propriete afin de deleter la sequence d'encaspidation suite a son introduction entre une sequence sens-antisens pouvant former une structure secondaire. Il a fallu etudier les effets d'une sequence antisens dans un vecteur retroviral depuis les cellules productrices en passant par l'encapsidation, et jusqu'au provirus integre. Cela a permis de mettre en evidence qu'une large sequence antisens (692nt) entrainait une instabilite des arnm vecteurs dans les cellules productrices suite a l'action de desaminases cellulaires sur les structures secondaires. Les arnm vecteurs modifies par cette activite et encapsides, donnent naissance a des provirus comportant dans 100% des cas la deletion de la totalite, ou presque, des sequences pouvant former une structure secondaire sur l'arn viral ; toutefois, les residus de sequences sens-antisens entrant dans la structure secondaire presentent une modification nucleotidique caracterisee par la transition ag. Pour rendre moins instables les arnm vecteurs, la sequence antisens situee en 3' de la sequence d'encapsidation a ete reduite a 48nt dans le vecteur pfas22. La production de ce vecteur en condition helper free a permis de mettre en evidence une stabilite des arnm vecteurs et un taux de deletion des sequences sens-antisens encadrant la sequence d'encapsidation de 61%. Ces resultats permettent d'obtenir des donnees fondamentales sur la presence et le devenir de structures secondaires pouvant se former sur un arnm viral et des donnees pouvant etre mises a profit dans le but d'optimiser les vecteurs retroviraux pour des applications de therapie genique.


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  • Détails : 1 vol. (97 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 79-97

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