Purification et caractérisation moléculaire de la protéine naturelle et recombinante P30 (SAG-1) de Toxoplasma gondii

par Frédérique Raymond

Thèse de doctorat en Sciences

Sous la direction de Dominique Rolland.

Soutenue en 1998

à Lyon 1 .

Le jury était composé de Dominique Rolland.


  • Résumé

    Dans le domaine de la sante publique, la toxoplasmose est un probleme epidemiologique d'importance chez les femmes enceintes et les malades immunodeprimes. Le role antigenique majeur d'une proteine membranaire de toxoplasma gondii de 30 kda (p30 ou sag-1) a ete largement decrit. L'integration de cette proteine dans un kit de detection des immunoglobulines humaines antitoxoplasmiques presente un interet diagnostique. A cette fin, le gene de la p30 a ete clone et exprime chez la levure schizosaccharomyces pombe sous deux formes : p30 recombinantes glycosylee et non glycosylee (a 0,7 g/ml dans le milieu). Le but de ce travail a d'abord consiste a optimiser la culture de ces deux souches pour obtenir un niveau d'expression de proteines recombinantes acceptable. Ainsi, la fermentation en continu permet d'obtenir une biomasse superieure a celle observee lors de fermentations en batch. Puis les techniques chromatographiques (echange d'ions et immunoaffinite) permettant la capture et la purification des proteines a partir du milieu de fermentation ont ete testees a l'echelle analytique (5 a 50 ml). Pour l'industrialisation (2 a 4 litres) de ces deux etapes, trois strategies de purification ont ete comparees : - clarification et concentration du milieu avant les chromatographies ; - clarification et purification par chromatographies conventionnelles en colonne remplie ; - purification des milieux bruts, directement en sortie de fermenteur, par chromatographie en lit fluidise, en utilisant le systeme streamline. La premiere etape de purification sur sulfo-propyl permet d'obtenir un rendement variant de 50 a 95%, pour un facteur de purification de 3 a 100. La deuxieme etape de polissage par immunoaffinite presente un rendement d'environ 50% pour un facteur final de purification de 500 a 7000. La proteine est obtenue avec une purete de l'ordre de 80%. Enfin, la caracterisation moleculaire des p30 recombinantes et de la p30 native extraite de t. Gondii a ete realisee (etude serologique, electrophorese 2d, spectrometrie de masse, sequencage). Ce travail a permis d'une part le developpement de techniques de fermentation et de purification de p30 recombinantes transposables a l'echelle industrielle, et d'autre part l'evaluation de l'activite antigenique de p30 recombinante pour le diagnostic de la toxoplasmose.


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Informations

  • Détails : 1 vol. (184 f.)
  • Annexes : Bibliogr. f. 170-184

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  • Bibliothèque : Université Claude Bernard (Villeurbanne, Rhône). Service commun de la documentation. BU Sciences.
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