Bioconversion du glycérol en 1,3-propanediol par Clostridium butyricum : clonage de gènes importants du métabolisme en vue d'approches d'ingénierie métabolique

par Patricia Sarcabal

Thèse de doctorat en Biologie et génétique moléculaires et cellulaires. Biotechnologie

Sous la direction de Philippe Soucaille.

Soutenue en 1998

à Toulouse, INSA .


  • Résumé

    La rentabilité du procédé de production de 1,3-propanediol à partir de glycérol par Clostridium butyricum passe par une amélioration du rendement de cette conversion. Les gènes clonés au cours de cette étude constituent l’outil de base pour envisager des approches d’ingénierie métabolique. Les gènes ptb et buk codant respectivement pour la phosphotransbutyrylase et la butyrate kinase de C. Butyricum ont été clonés dans E. Coli et séquencés. Ces gènes, organisés en opéron transcriptionnel, constituent la cible de l’inactivation de la voie du butyrate, co-produit inhibiteur de la fermentation du glycérol. L’inactivation par recombinaison homologue au locus via un plasmide intégratif a nécessité le développement d’outils de génétique réverse pour C. Butyricum. Deux techniques : l’électrotransformation et la mobilisation conjugative, ont permis de transférer de l’ADN plasmidique dans la souche. La souche mutante recherchée n’a pas été obtenue, les efficacités de transfert d’ADN restant trop faibles pour sélectionner un évènement de recombinaison homologue. Le second axe de recherche a porté sur le clonage des gènes codants pour les enzymes impliquées dans la conversion du glycérol en 1,3-propanediol chez C. Butyricum : la glycérol déshydratase et la 1,3-propanediol déshydrogénase. Les gènes putatifs d’une glycérol déshydratase d’un nouveau type (orf11, orf12) et de la 1,3-propanediol déshydrogénase (dhaT) ont été clonés dans E. Coli et séquencés. En amont de ces gènes de la voie de réduction du glycérol en 1,3-propanediol, les gènes putatifs de la glycérol déshydrogénase (dhaD2) et de la dihydroxyacétone kinase (dhaK1, dhaK2), enzymes de la voie d’oxydation du glycérol vers la glycolyse, ont été identifiés. La régulation au niveau transcriptionnel de ces gènes et l’organisation en opéron polycistronique des gènes [dhaD2, dhaK1, dhaK2] d’une part, et des gènes [orf11, orf12 et dhaT] d’autre part, ont été montrées. L’expression de ces deux opérons dans Clostridium acetobutylicum permettra de conclure quant à la nature exacte des fonctions codées par ces gènes. L’organisation globale des gènes clonés chez C. Butyricum diffère de celle décrite chez Citrobacter freundii ou Clostridium pasteurianum, organismes également producteur de 1,3-propanediol.

  • Titre traduit

    Bioconversion of glycerol to 1,3-propanediol by Clostridium butyricum : cloning of key genes for futures metabolic engineering approachs


  • Pas de résumé disponible.


  • Résumé

    Rentability of 1,3-propanediol production process from glycerol by Clostridium butyricum requires an improvement in this conversion yield. Cloned genes in this study constitute useful tools for futures metabolic engeenering approachs. Ptb and buk genes encoding respectively for phosphotransbutyrylase and butyrate kinase from C. Butyricum have been cloned in E. Coli and sequenced. These genes are organized on a transcriptional operon. As butyrate is an inhibitory product of glycerol fermentation, our aim was to inactivate butyrate formation pathway by homologous recombination via an integrative plasmid. Previously, the development of genetic tools for C. Butyricum was necessary. Electrotransformation or conjugative mobilization allowed us to transfer plasmidic DNA into C. Butyricum. Improvement in these technics should permit us the selection of recombinant strains. On an other hand, our objective was the cloning in E. Coli, of the genes encoding the two enzymes involved in the conversion of glycerol to 1,3-propanediol: glycerol dehydratase and 1,3-propanediol dehydrogenase. Putative genes encoding 1,3-propanediol dehydrogenase (dhaT) and glycerol dehydratase (orf11, orf12) have been identified. These genes are located downstream from the oxidative branch genes encoding glycerol dehydrogenase (dhaD2) and dihydroxyacetone kinase (dhaK1, dhaK2). Northern blot experiments suggest that [orf11, orf12, dhaT] genes on an hand and [dhaD2, dhaK1, dhaK2] genes on the other hand are organized as a transcriptional operon. Expression of both operon is regulated at the transcriptional level. Expression of these operons in Clostridium acetobutylicum would allow us to determine fonctions encoded by these genes. Further expression of these genes in various organisms which do not produce1,3-propanediol is envisaged.

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Informations

  • Détails : 255 p.
  • Notes : Publication autorisée par le jury après une période de confidentialité de 6 mois
  • Annexes : Bibliogr. p. 185-205

Où se trouve cette thèse\u00a0?

  • Bibliothèque : Institut national des sciences appliquées. Bibliothèque centrale.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1998/480/SAR
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