Caracterisation fonctionnelle de ferredoxines 2fe-2s de type xylt impliquees dans la biodegradation d'hydrocarbures aromatiques

par NICOLAS HUGO

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de YVES JOUANNEAU.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La bacterie pseudomonas putida mt-2 est capable d'utiliser le toluene ou le xylene comme unique source de carbone, grace aux genes xyl, responsables du catabolisme des hydrocarbures aromatiques. La catechol 2,3-dioxygenase (xyle) catalyse le clivage oxygenolytique du cycle aromatique. Xyle est une enzyme instable qui est inactivee par le 4-methylcatechol forme lors de la degradation du p-xylene et du p-toluate. Des travaux anterieurs ont montre que la proteine xylt, codee par le gene xylt, serait a l'origine d'un mecanisme de reactivation ou de stabilisation de la catechol 2,3-dioxygenase in vivo. Au cours de ce travail, nous avons etudie le mecanisme de reactivation de xyle in vitro par des approches biochimiques et spectroscopiques. Les proteines xylt et xyle ont ete purifiees et caracterisees. La proteine xylt a ete purifiee pour la premiere fois au cours de cette etude. Il s'agit d'une ferredoxine (fd) a centre 2fe-2s tres originale, dont la sequence en acides amines lui confere un caractere basique. La dioxygenase xyle purifiee a ete inactivee par le 4-methylcatechol. L'analyse par rpe a montre que l'inactivation resulte de l'oxydation de l'ion fe#2#+ du site actif de l'enzyme. La preparation de xyle inactivee a pu etre reactivee in vitro par des quantites catalytiques de xylt en presence d'un reducteur photoactivable. En se basant sur une serie d'analyses, et notamment des resultats de rpe de complexes xyle-no, nous avons conclu que xylt reactive xyle par reduction du fe#3#+ en fe#2#+ au site actif de l'enzyme. Ainsi, xylt fonctionne comme une activase specifique de xyle. L'interaction entre xylt et xyle a ete etudiee par des experiences de pontage covalent et par la methode de resonance plasmonique de surface. Xylt est indispensable a la croissance sur p-toluate. Dans un mutant xylt, l'introduction du gene xylt en trans retablit des facultes de croissance normales. Trois fd, analogues de xylt, ont ete egalement ete purifiees. Elles sont similaires a xylt et capables de remplacer xylt dans la reactivation de xyle a la fois in vivo et in vitro. Les proteines de type xylt apparaissent comme une nouvelle sous-classe de fd 2fe-2s dont la fonction est la reactivation des catechol dioxygenases. Le mecanisme de reactivation mis en evidence permet d'elargir la gamme de substrats aromatiques que les bacteries peuvent metaboliser.


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  • Détails : 164 P.
  • Annexes : 175 REF.

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