La ribonucleotide reductase d'a. Thaliana : surexpression, purification et caracterisation de ses deux sous-unites

par SANDRINE SAUGE MERLE

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Marc Fontecave.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La biosynthese des desoxyribonucleotides, elements de base des chaines de l'adn, resulte de la reduction des ribonucleotides correspondants. Cette reaction essentielle est catalysee par une seule enzyme chez tous les organismes vivants : la ribonucleotide reductase (rnr), utilisant un mecanisme radicalaire. Actuellement, trois classes de rnrs ont ete identifiees et sont relativement bien definies. Parmi celles-ci, les rnrs de la classe i regroupent les enzymes de la plupart des eucaryotes ; elles sont composees de deux sous-unites homodimeriques r1 (#2) et r2 (#2) dont l'association permet la formation d'un complexe de type #2#2. Curieusement, la rnr des vegetaux n'a pas encore ete repertoriee. La caracterisation de la rnr des vegetaux superieurs et en particulier celle d'arabidopsis thaliana est l'objet de ce manuscrit. La sequence nucleotidique codante pour la proteine r1 a ete isolee du genome d'a. Thaliana, permettant ainsi la surexpression de cette proteine dans e. Coli et sa purification. La proteine r2 a egalement ete surexprimee et purifiee. La caracterisation de ces deux proteines a permis d'apparenter la rnr d'a. Thaliana a une enzyme de la classe i. Cette derniere est composee par un dimere de r1 et un dimere de r2. L'etude de la proteine r2 confirme, apres une etape d'activation, la presence des centres redox habituellement trouves chez les rnrs de cette classe. Il s'agit d'un radical tyrosinyle stable et d'un centre binucleaire de fer ferrique a pont oxo par chaine polypeptidique. L'association des proteines recombinantes genere le complexe fonctionnel, capable de reduire un ribonucleotide. L'enzyme est controlee par la regulation allosterique habituellement observee dans la classe i. La reduction du substrat cdp est stimulee en presence d'atp et est inhibee en presence de datp. Par contre, c'est la premiere fois qu'une activite ribonucleotide reductase vegetale est mesuree in vitro a partir d'un systeme purifie. L'interet porte a la rnr de plante est lie aux applications pratiques qui pourraient en resulter dans le domaine de l'agrochimie. En effet, cette enzyme serait une cible de choix pour la conception de nouveaux herbicides. L'obtention de cette proteine et sa caracterisation autorisent maintenant des etudes en ce sens.


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  • Détails : 272 P.
  • Annexes : 188 REF.

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