Etudes cryocristallographiques du site actif des hydrogenases a nickel de desulfovibrio gigas et desulfomicrobium baculatum

par ELSA GARCIN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de JUAN FONTECILLA CAMPS.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Les hydrogenases sont des enzymes qui catalysent la production ou la consommation de l'hydrogene moleculaire selon la reaction suivante : h#2 2h#+ +2e. L'hydrogenase de desulfovibrio gigas existe sous differents etats redox, appeles etats inactif, pre-actif (formes oxydees) et actif (forme reduite). La structure de l'hydrogenase de d. Gigas dans son etat oxyde, a une resolution de 2,85a, a montre que la proteine contenait deux agregats 4fe4s et un agregat 3fe4s, situes dans la petite sous-unite. Le site actif est enfoui dans la grande sous-unite et contient un atome de nickel, ainsi qu'un autre site metallique a proximite du nickel, probablement un fer et appele atome x. Une experience de dispersion anomale au seuil d'absorption du fer a montre pour la premiere fois que le site actif etait compose d'un atome de nickel et d'un atome de fer a une distance de 3a. Les deux metaux sont coordonnes par quatre cysteines dont deux sont pontantes entre les deux metaux ; l'atome de fer possede egalement trois ligands de nature inconnue et modelises comme trois molecules d'eau. L'analyse de la structure de la forme oxydee obtenue a 2,54a de resolution sur une autre forme cristalline a montre la presence d'un ligand pontant entre les deux metaux, modelise comme une espece oxygenee. D'autre part, en parallele avec des etudes infrarouges sur l'hydrogenase de chromatium vinosum, les trois ligands du fer ont ete attribues a des especes diatomiques du type co/cn. Une etude des differents etats redox est necessaire afin de mieux comprendre le mecanisme catalytique. L'installation d'une boite a gants ainsi que la mise au point de techniques de reduction et de congelation des cristaux ont donc ete realisees. La structure de l'hydrogenase a ni-fe-se de desulfomicrobium baculatum dans son etat reduit a ete determinee a une resolution de 2,15a par la methode du remplacement moleculaire. D'autre part, nous avons egalement obtenu la structure de l'hydrogenase de d. Gigas sous sa forme reduite a une resolution de 2,7a. Une comparaison des sites actifs des deux hydrogenases dans les etats oxyde et reduit fait apparaitre un certain nombre de differences. Sur la base des differentes structures, nous pouvons proposer un mecanisme d'activation.


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  • Détails : 149 P.
  • Annexes : 164 REF.

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