Caracterisation de la structure en domaines de la prolyl oligopeptidase de flavobacterium meningosepticum

par SARAH VIAL

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Jean Gagnon.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Le travail de cette these a consiste en l'etude de la caracterisation en domaines de la prolyl oligopeptidase (pop) de flavobacterium meningosepticum. Cette proteine appartient a une famille de proteases a serine, differente de celles de la chymotrypsine, de la subtilisine ou de la carboxypeptidase y. La structure tridimensionnelle des prolyl oligopeptidases ainsi que celle des endopeptidases specifiques des residus proline est encore inconnue. Cependant, base sur des analyses de predictions de structures secondaires et de comparaisons de sequences, il a ete suggere que cette famille de proteases serait constituee de deux domaines. Un domaine catalytique c-terminal constitue des 300 derniers residus c-terminaux de la pop qui presenterait un repliement / caracteristique de certaines hydrolases, et un domaine n-terminal d'environ 200 residus n'ayant aucune similarite avec des proteines de structures tridimensionnelles connues. Afin d'investiguer la possible structuration en domaines de la proteine, la digestion menagee a alors ete testee par l'utilisation de plusieurs proteases comportant des specificites diverses. Les resultats ont revele que la proteolyse limitee de la pop par la chymotrypsine ou l'elastase qui possedent des specificites de coupure differentes, genere un petit fragment n-terminal de 22901 da (residus 1 a 198) appele domaine n-terminal et un plus gros presentant une masse de 54049 da (residus 199 a 685) nomme domaine c-terminal, qui porte le site catalytique. L'association de ces deux fragments porte le nom de proteine clivee (pop-clivee). Les resultats ont demontre que sous des conditions de proteolyse controlees, la digestion de la prolyl oligopeptidase par la chymotrypsine ou l'elastase genere le clivage d'une seule liaison peptidique, l198 - s199, suggerant l'accessibilite de cette liaison. Il a ete demontre que l'association de ces deux fragments (pop-clivee) possede toujours une activite prolyl oligopeptidase, cependant la coupure d'une simple liaison peptidique a entraine une diminution de l'activite enzymatique de la proteine clivee, car elle ne presente plus que 24,4% de l'activite de depart de la proteine intacte. De par l'identite des domaines, les resultats permettent de suggerer que le domaine c-terminal portant le site catalytique, present dans la pop-clivee, est responsable de l'activite enzymatique. Dans le but de verifier si le domaine c-terminal peut fonctionner seul, et comprendre l'influence possible du domaine n-terminal, nous avons entrepris d'isoler les fragments resultats de la proteolyse. Les conditions mises en oeuvre pour la separation etant drastiques, une etude preliminaire de renaturation du domaine catalytique par dilution de l'agent denaturant a ete faite. Elle a indique qu'il est possible de retrouver une activite prolyl oligopeptidase. Ainsi dans le but de controler le repliement du domaine c-terminal et d'etudier les interactions inter-domaines de la pop, une etude plus approfondie du repliement de la proteine intacte et de la proteine clivee a ete realisee. Les transitions de denaturation et renaturation de la pop intacte et de la pop clivee ont ete etudiees dans des conditions a l'equilibre, en fonction de la concentration d'uree, en suivant plusieurs parametres comme l'activite enzymatique, le signal de dichroisme circulaire, l'emission de fluorescence et la susceptibilite proteolytique. Ce travail a montre que les transitions de denaturation-renaturation de la proteine intacte et clivee sont reversibles ce qui indique que lorsque les domaines sont renatures ensemble, la pop intacte ou la pop-clivee peuvent etre renaturees apres traitement avec l'uree. Dans le but d'investiguer le role de chacun des domaines dans le processus de repliement de la pop, l'etude de transition de renaturation des domaines a ete faite. Les resultats ont indique que le domaine c-terminal se comporte comme une entite independante de repliement car il est capable de retrouver une structure quasi-native ainsi qu'une activite. En revanche, le domaine n-terminal n'est pas capable de retrouver sa structure native. Toutefois une etude de susceptibilite proteolytique a revele qu'une large portion de ce domaine est resistante a la digestion proteolytique, ce qui semble suggerer que le domaine n-terminal atteint un etat intermediaire structure non natif.


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Informations

  • Détails : 153 P.
  • Annexes : 130 REF.

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