Etude conformationnelle et structurale de l'acetohydroxy acide isomeroreductase de plante par echanges hydrogene/deuterium et spectrometrie de masse

par FREDERIC HALGAND

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Eric Forest.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La combinaison des echanges hydrogene/deuterium avec la spectrometrie de masse en mode d'ionisation electrospray est devenue un outil tres precieux pour l'obtention d'informations conformationnelles et dynamiques sur les proteines. La methodologie decrite par zhang et smith en 1993 (zhang, z. & smith, d. L. (1993). Protein sci 2(4), 522-31). Pour le fab-ms a ete adaptee pour notre etude a l'esi-ms. Mise au point sur le cytochrome c#2 de rhodobacter capsulatus, puis teste en etudiant l'influence structurale de mutations, cette methode d'etude conformationnelle par echanges h/d et esi-ms a ete appliquee a une enzyme de plante, cible potentielle d'herbicide, l'acetohydroxy acide isomeroreductase. Le but de nos etudes etait de caracteriser les changements conformationnels lie a la fixation sequentielle des ligands (ions mg#2#+, nadph et un inhibiteur competitif, le n-hydroxy-n-isopropyloxamate, ipoha). Nous avons ainsi montre que les ions mg et le nadph participaient a la structuration du site actif de l'enzyme necessaire a la fixation du substrat et/ou d'un inhibiteur competitif. Par ailleurs, nous avons montre qu'ipoha etait completement enfoui dans le site actif, rigidifiant ce dernier et empechant par la meme son relargage. Ceci explique en partie son caractere quasi-irreversible. Enfin, le dimere de cette enzyme semble jouer un role important dans la dynamique de cette enzyme, nombre de changements conformationnels ayant ete identifies a l'interface des deux monomeres. Ces resultats ont fournis de precieux renseignements pouvant eventuellement servir a la conception de nouveaux herbicides. Dans le but de mieux comprendre l'action de cet inhibiteur competitif et le comportement du dimere de l'isomeroreductase, des mesures de masse des complexes non-covalents de l'isomeroreductase avec ses differents ligands ont ete entreprises. Les resultats ont permis de confirmer que la stoechiometrie de fixation des ligands est en parfait accord avec les experiences de biochimie et de cristallographie. L'isomeroreductase etant une cible herbicide, un screening haute capacite a ete pratique sur celle ci. La mise en evidence d'une nouvelle classe d'inhibiteurs de la famille des thiadiazoles, actifs a des doses de l'ordre de la picomole par l suggerait un lien covalent entre l'enzyme et l'inhibiteur. Nous avons alors montre le caractere covalent de ce lien pour l'un d'eux, puis caracterise le mode d'action et le site d'inhibition de ce dernier.


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  • Détails : 161 P.
  • Annexes : 108 REF.

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