Caracterisation moleculaire et biochimique de la monogalactosyldiacylglycerol synthase (mgdg synthase) de l'enveloppe des chloroplastes d'epinard

par CHRISTINE MIEGE

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de JACQUES JOYARD.

Soutenue en 1998

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    Au debut de ce travail, aucune donnee moleculaire n'etait connue sur la mgdg synthase, l'enzyme qui synthetise le lipide polaire majeur des membranes plastidiales. En l'absence d'outil moleculaire nous avons d'abord tente d'identifier l'enzyme en alliant une technique de marquage differentiel sur gel a la separation des polypeptides de l'enveloppe par electrophorese bidimensionnelle. Malheureusement les proteines hydrophobes de l'enveloppe precipitaient a leur point isoelectrique dans les gels bidimensionnels preparatifs. Neanmoins cette etude a servi de base a l'amelioration de l'electrophorese bidimensionnelle appliquee aux proteines membranaires. Nous avons ensuite tente d'exploiter une analogie possible entre la mgdg synthase et les dgk. Par une approche combinant l'utilisation d'outils immunologiques et moleculaires, nous avons obtenu un adnc codant pour une proteine nouvelle ch22, reconnue par un antiserum dresse contre la dgk bacterienne. Cependant, ch22 est localisee dans les thylacoides et ne correspond pas au polypeptide d'enveloppe recherche. Ces travaux ont revele un polypeptide de 120 kda dans l'enveloppe des chloroplastes. Ch22 possede une est chez arabidopsis mais n'est homologue a aucune proteine de fonction connue. Nos travaux suggerent que ch22 pourrait posseder une activite de type dgk. Grace au clonage recent de la mgdg synthase de concombre, nous avons obtenu l'adnc de l'enzyme d'epinard par criblage heterologue d'une banque d'epinard avec une sonde nucleique de concombre. La mgdg synthase d'epinard (47 kda) est tres homologue aux enzymes de concombre et d'arabidopsis. Son identite a ete confirmee par expression fonctionnelle de la proteine recombinante chez e. Coli. L'enzyme recombinante possede les memes proprietes chromatographiques et fonctionnelles que l'enzyme native issue de l'enveloppe. Le precurseur de la mgdg synthase est importe dans les chloroplastes. Les mesures de masse moleculaire fonctionnelle indiquent que l'enzyme est vraisemblablement un homodimere. L'extraction menagee de l'enzyme hors de vesicules d'enveloppe suggere que le dimere est monotopique, ancre dans un des feuillets de la membrane interne de l'enveloppe. La mgdg synthase renaturee a partir des corps d'inclusion bacteriens sera precieuse pour de futures etudes structurales et fonctionnelles.


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  • Détails : 176 P.
  • Annexes : 370 REF.

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