Étude de la sporamine recombinante exprimée dans le tabac : purification par chromatographie d'affinité pour les ions métalliques immobilisés (IMAC) et caractérisation par spectrométrie de masse en mode électrospray (ESI-MS)

par Yannick Boulis

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Mookambeswaran A. Vijayalakshmi.

Soutenue en 1998

à Compiègne , dans le cadre de École doctorale 71, Sciences pour l'ingénieur (Compiègne) .

mots clés

• Sporamine
• Protéines recombinées
• Protéines -- Purification
• Tabac
• Plantes transgéniques
• Chromatographie d'affinité
• Chromatographie par échange d'ions
• Spectrométrie de masse avec ionisation électrospray
• Ions métalliques

Résumé

La production de protéines dans les plantes transgéniques nécessite la mise au point de techniques de purification simples et efficaces, et la caractérisation fine des changements structuraux, en particulier des modifications post-translationnelles. L'étude de ces modifications a été réalisée en utilisant comme modèle la sporamine, protéine présente naturellement dans la patate douce. Les méthodes de purification et d'analyse ont été développées sur la sporamine de patate douce, puis adaptées à différentes constructions de sporamine recombinante exprimées dans le tabac. La chromatographie d'affinité avec les ions métalliques immobilisés (IMAC) a été utilisée comme outil de purification. Une analyse fine des modifications a été réalisée par spectrométrie de masse en mode électrospray (ESI-MS). La rétention de la sporamine de patate douce est observée sur gel Sépharose-6B-IDA-Cu(ll). L'analyse par SDS-PAGE et western blot montre que la sporamine est éluée à 6mM d'imidazole, totalement purifiée. L'analyse par ESI-MS permet de détecter plusieurs entités, mettant ainsi en évidence des modifications très fines au niveau du site de clivage du propeptide. Pour les différentes constructions exprimées dans le tabac, plusieurs fractions (éluées majoritairement à 5 et/ou 10 mM d'imidazole), contenant la sporamine, ont été obtenues. La masse de la ou des différentes entités présentes dans ces fractions peut être déterminée avec précision par ESI-MS. La maturation des différentes constructions de sporamine recombinante peut alors être étudiée. Cette approche nouvelle offre l'avantage d'être à la fois plus sensible (détection d'espèces minoritaires) et plus précise (analyse de la masse, à l'échelle de l'acide aminé) que les méthodes classiques utilisées jusqu'alors.

Titre traduit

Study of recombinant sporamin expressed in tobacco : purification by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)

Pas de résumé disponible.