Etude des adn-topoisomerases de type i chez une famille de bacteries thermophiles, les thermotogales : clonage, sequencage et expression dans e.coli

par HABIB KALTOUM

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Michel Duguet.

Soutenue en 1997

à Paris 11 .

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  • Résumé

    Deux activites topoisomerases de type i sont presentes dans les extraits cellulaires des especes bacteriennes thermophiles appartenant a l'ordre des thermotogales : une activite reverse gyrase et une activite topoisomerase i type. Dans un premier temps, nous nous sommes interesses a la purification de la proteine responsable de l'activite de relaxation, atp-independante chez f. Islandicum. Ses principales caracteristiques enzymatiques ont ete definies ; elles sont tres voisines de celles de la proteine d'e. Coli. L'obtention de sequences peptidiques internes a permis de definir des oligonucleotides degeneres qui ont ete utilises pour amplifier un premier fragment du gene servant ensuite de sonde pour cloner l'integralite du gene. Le gene equivalent a egalement ete clone chez t. Maritima. L'analyse comparative des sequences peptidiques de ces deux topoisomerases i thermophiles montre qu'elles sont strictement apparentees a leurs homologues mesophiles ; elles sont toutefois plus riches en residus charges. Pour mieux etudier les caracteristiques fonctionnelles et structurales de cette classe d'enzymes thermophiles, nous avons construit un vecteur d'expression heterologue portant le gene codant pour la topoisomerase i de t. Maritima. La proteine recombinante a ete exprimee dans e. Coli et purifiee. Celle-ci est active in vitro, a des temperatures proches de 80c, suggerant qu'aucun facteur specifique de la souche hote d'origine n'est indispensable pour que la proteine thermophile adopte sa conformation native. Une etude des proprietes de la proteine recombinante par mutagenese dirigee est en cours. Les premiers resultats indiquent que l'unique motif tetracysteine, present a son extremite c-terminale, n'est pas indispensable pour son activite catalytique. Nous poursuivons cette etude et travaillons egalement a l'amelioration du rendement de son expression dans l'objectif de cristalliser la proteine dans sa totalite.


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  • Détails : 154 P.
  • Annexes : 176 REF.

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  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
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  • Cote : TH2014-013468
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