Imagerie et quantification de haute sensibilite d'adn fixe sur membrane par chimiluminescence

par GEORG DORNER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de RAINER SIEBERT.

Soutenue en 1997

à Paris 11 .

    mots clés mots clés


  • Résumé

    La these presentee a pour objectif la mise au point de methodes de marquage d'acides nucleiques sur membrane par chimiluminescence (dans les reactions catalysees par l'enzyme alkaline phosphatase (ap)) et le developpement de son systeme de revelation associe. Offrant une alternative performante a la detection classique par radioisotope dans les experiences de biologie moleculaire, cette technique devrait permettre de realiser des etudes quantitatives de haute sensibilite necessaires notamment aux methodes de revelation d'expression genique par criblage differentiel. Notre travail s'est deroule selon trois etapes : - l'installation et la caracterisation d'un imageur base sur un ccd refroidi couple a une optique standard (50 mm/fl. 2). De surface d'analyse maximale 625 cm#2, ce systeme possede une resolution spatiale comprise entre 300 m et 1 mm (selon la taille de la surface d'analyse choisie) et une sensibilite suffisante pour detecter 10 fg/mm#2 d'adn marque ; - l'optimisation realisee a partir d'etudes systematiques des differents parametres influencant le processus chimiluminescent en solution (ph, temperature, concentration du substrat et de l'enzyme). Les substrats ayant produit le meilleur rapport signal sur bruit (cdp-star associe a l'enhancer emerald ii et le produit lumiphos plus) ont permis de quantifier une quantite d'ap allant jusqu'a 10#-1#5 m pour une dynamique superieure a 10#4 ; - consecutivement, l'optimisation de la preparation, de l'immobilisation et de la detection de brins d'adn marquees par un complexe biotin-streptavidine-biotin-ap. Nous avons pu ainsi etablir une relation lineaire entre la quantite de sonde fixee (10fg/mm#2 -100pg/mm#2) et l'intensite du nombre de photons mesuree. De plus, nous avons mene des tests d'hybridation de sondes d'adn temoins clones dans des bacteries et fixes sur des filtres. Outre la determination des conditions optimales d'hybridation (temperature, tampons, temps d'hybridation), ces tests nous ont amene a developper une methode de reduction de bruit sur membrane basee sur l'activite digestive d'une proteinase. Les derniers resultas de nos experiences indiquent, ue les conditions majeures our un criblage differentiel fiable sont remplie en utilisant des sondes froides.


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  • Détails : 137 P.
  • Annexes : 143 REF.

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  • Disponible pour le PEB
  • Bibliothèque : Centre Technique du Livre de l'Enseignement supérieur (Marne-la-Vallée, Seine-et-Marne).
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TH2014-013282
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