Evaluation de l'efficacite d'un nouveau vecteur retroviral pour le transfert de genes dans les cellules hematopoietiques humaines

par LUZ MARINA RESTREPO MUNERA

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de ODILE COHEN HAGUENAUER.

Soutenue en 1997

à Paris 7 .

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  • Résumé

    Le travail experimental a porte principalement sur l'evaluation de la capacite d'un vecteur derive du virus de friend a des titres infectieux eleves a infecter des precurseurs hematopoietiques humains. Seuls les clones producteurs derives de la lignee d'empaquetage amphotrope psi-crip ayant permis de transduire avec la plus haute efficacite le gene d'interet (neo#r) ont ete retenus et amplifies ; un systeme de mcb (master cell bank) a ete constitue afin de disposer d'une source homogene de cellules, bien caracterisee sur le plan de la securite, et dont le titre infectieux s'est avere suffisamment stable. Plusieurs procedures d'infection retrovirale ont ete testees : infection par co-culture avec la lignee productrice du virus, infection par surnageant filtre et infection par systeme transwell. L'utilisation du seul surnageant viral a donne des resultats satisfaisants et offre des garanties de securite maximales pour les applications cliniques. Les infections ont ete realisees en presence de combinaisons variees de facteurs de croissance ou bien en presence ou en l'absence des cellules stromales. Notre choix de facteurs de croissance a porte sur le lif (leukemia inhibitory factor), l'il-6, l'il-3, l'epo (erythropoietine) et le scf (stem cell factor) et sur l'exploitation de la lignee stromale ms-5. Les cellules cibles cd34+ ont ete obtenues a partir de sang placentaire (cordon ombilical), moelle osseuse et sang peripherique (obtenus de malades atteints de cancer). Afin de maintenir la totipotence des precurseurs et eviter la stimulation de cellules cancereuses contaminantes, nous avons favorise l'utilisation de concentrations de facteurs minimales. La combinaison scf (stem cell factor) 10 ng/ml et lif (leukemia inhibitory factor) 10 u/ml a ete retenue comme la plus interessante. L'infection directe en absence de pre-stimulation a montre egalement une efficacite compatible avec des protocoles de transduction sans facteur de stimulation, principalement pour les cellules souches du sang peripherique. Nous avons obtenu une proportion significative de transduction sur les differentes cibles utilisees, en particulier a partir de surnageants viraux. Les efforts realises pour determiner l'efficacite de transduction a long terme sur le systeme xenogenique (stroma a partir de la lignee cellulaire ms-5) ont ete decevants. Cependant quelques experiences ont montre la presence de ltc-ic (long term culture-initiating cells) exprimant le transgene apres une culture en selection a long terme ; dans deux cas nous avons obtenu un signal pcr positif a partir de colonies derivees de cfu-gm generes de ces cultures maintenues en selection a long terme.


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Informations

  • Détails : 200 P.
  • Annexes : 378 REF.

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  • Bibliothèque : Université Paris Diderot - Paris 7. Service commun de la documentation. Bibliothèque Universitaire des Grands Moulins.
  • Accessible pour le PEB
  • Cote : TS1997
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