Lissage chimique de la stabilite thermique des duplex d'adn pour l'analyse fine et le sequencage des acides nucleiques par hybridation

par HONG-KHANH NGUYEN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Ulysse Asseline.

Soutenue en 1997

à Orléans .

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  • Résumé

    Le sequencage par hybridation implique le lissage de la difference de la stabilite thermique des duplex d'acides nucleiques en fonction de leur composition en bases. Pour atteindre cet objectif nous avons etudie plusieurs voies d'approche basees sur la modification des paires de bases at et/ou gc afin d'egaliser leur stabilite. L'une des strategies utilisees concerne la synthese et les etudes de la dissociation thermique des duplex d'adn composes d'analogues de la 2'-desoxycytidine. Ce travail a permis de selectionner la n-4-ethyl-2'-desoxycytidine (d#4#e#tc) qui forme specifiquement avec la 2'-desoxyguanosine la paire de bases g#4#e#tc ayant une stabilite thermique equivalente a celle de la paire de bases at. De nombreux duplex constitues des paires de bases at et/ou g#4#e#tc ont ete synthetises et leurs etudes ont montre qu'ils possedent des dissociations thermiques tres cooperatives et independantes de leur composition en bases. Ce nouveau systeme necessite le remplacement de la dc par la d#4#e#tc dans les deux brins de la double-helice. La preparation des oligonucleotides sondes peut etre facilement realisee par synthese chimique. Nous avons montre que l'incorporation de la pd#4#e#tc dans les fragments d'adn via la kleenow ou la taq polymerase et les datp, dgtp, dttp et d#4#e#tctp est efficace et specifique. D'autre part afin de mettre au point un systeme possedant une stabilite thermique plus elevee que celui decrit precedemment, nous avons etudie un deuxieme systeme de duplex dans lequel les deux paires de bases at et gc sont simultanement modifiees. Nous avons ainsi montre que des duplex composes de neuf paires de bases et constitues des paires de bases a#5#p#r#o#pu ou g#4#m#ec possedent des stabilites thermiques tres voisines. Ce systeme permet un gain de stabilite de l'ordre de 12c par rapport au premier systeme de duplex. En vue d'exploiter l'effet differentiel de l'ion tetramethylammonium tma#+ vis a vis des paires de bases at et gc, nous avons etudie la stabilite thermique des duplex naturels et modifies dans des solvants chaotropiques. Ces etudes ont montre que l'utilisation du tmac1 en complement a la modification chimique des duplex permet d'une part un ajustage fin des tm et d'autre part d'obtenir d'autres systemes de duplex ayant des temperatures d'isostabilisation variees.


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Informations

  • Détails : 171 P.
  • Annexes : 180 REF.

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