Analyse genetique d'enzymes responsables de la resolution des acides amines de la serie l a partir de derives n-substitues chez la bacterie thermophile bacillus stearothermophilus

Genetic analysis of enzymes responsible for resolution of n-substituted l-amino acids in thermophilic bacterium bacillus stearothermophilus

• Auteur / Autrice : NADINE BATISSE
• Direction : Vehary Sakanyan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie
• Date : Soutenance en 1997
• Etablissement(s) : Nantes

Résumé

Les aminoacylases, les carbamoylases (respectivement n-acetyl et n-carbamoyl amino acide amidohydrolase) et les hydantoinases (hydantoine amidohydrolase) sont des enzymes importantes pour la resolution stereospecifique des acides amines. Leur organisation genetique leur regulation et leur role physiologique restent obscurs. Nous avons choisi d'etudier ces enzymes chez une bacterie thermophile, bacillus stearothermophilus, en raison de l'interet que represente leur thermostabilite en biocatalyse. Notre equipe ayant deja isole, a partir de la souche b. Stearothermophilus ncib8224, le gene codant pour une l-aminoacylase, amaa, un fragment d'adn de 4839 pb contenant, outre le gene amaa, le gene amab codant pour une carbamoylase a ete clone et analyse. Celui-ci a ete surexprime chez escherichia coli pour caracteriser l'enzyme recombinante: de poids moleculaire sous-unitaire 44 kda, elle est l stereospecifique, thermostable (50% d'activite residuelle a 70c) et metallodependante. L'analyse transcriptionnelle prouve que les genes amab et amaa constituent un operon ama conserve au sein de l'espece b. Stearothermophilus. La regulation de l'expression des deux amino acides amidohydrolases chez b. Stearothermophilus depend de la phase de croissance ainsi que de la composition du milieu de culture. La similarite des sequences des genes ama, leur organisation en operon et les affinites structurales et fonctionnelles de leurs enzymes suggerent leur evolution a partir d'un ancetre commun. La souche de b. Stearothermophilus ncib8224 possede egalement une activite hydantoinase. Differentes approches ont permis d'isoler une partie du gene correspondant qui a servi de reference pour cloner ce gene entier a partir d'autres souches de b. Stearothermophilus par notre equipe. Un systeme original d'expression regulable de genes heterologues a ete construit chez e. Coli en utilisant le promoteur parg de b. Stearothermophilus, le gene codant pour le represseur arginine de b. Subtilis et le gene amaa. En raison de la thermostabilite et du dosage facile de son produit, le gene amaa constitue, en effet, un adequat marqueur de selection ou rapporteur pour le clonage d'adn dans des bacteries hyperthermophiles.