Conception et synthèse d'inhibiteurs pour l'étude du site actif d'une UDP-glucuronosyltransférase recombinante hépatique humaine : l'ugt1*6

par Virginie Cano

Thèse de doctorat en Biochimie analytique structurale et métabolique

Sous la direction de Gérard Siest.

Soutenue en 1997

à Nancy 1 .


  • Résumé

    Des molécules originales, inhibiteurs des UDP-glucuronosyltransférases, ont été conçues, synthétisées puis testées. Ces composés constituent des sondes précieuses pour explorer l'organisation des sites actifs de ce groupe de protéines impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques, dont les médicaments, et dans celui de substances endogènes (bilirubine, acides rétinoïques,. . . ). Les molécules synthétisées, dont la structure est analogue à celle du substrat, l'acide UDPglucuronique, permettent de caractériser plus spécifiquement le domaine peptidique interagissant avec ce co-facteur. Les principaux résultats obtenus à l'issue de ce travail sont regroupés en trois parties principales correspondant aux trois groupes d'inhibiteurs considérés. 1- Une série chimique composée d'une cinquantaine de molécules dérivées de l'uridine a été synthétisée en faisant varier la nature des motifs chimiques positionnés successivement sur le cycle pyrimidique de l'uracile ou sur les groupements 2', 3' et 5' du ribose. L'effet inhibiteur de chaque molécule a d'abord été estimé d'après la mesure des 150. Pour les inhibiteurs les plus performants, une analyse cinétique détaillée a été entreprise visant à déterminer la constante d'inhibition ainsi que le mode d'inhibition. 2- Ces inhibiteurs ont été comparés à ceux précédemment obtenus au laboratoire comme les acides arylalkyl carboxyliques (inhibiteurs compétitifs) et les N-acyl-phénylamino alcools reliés par un bras espaceur à l'uridine (analogues de l'état de transition). En particulier, ils ont été utilisés pour caractériser le site de fixation de la 4-méthylombelliférone de l'UDP-glucuronosyltransférase 1. 6 après mutation des acides aminés Histidine 54 et Arginine 52 (Mutants H54A, H54Q, R52A). 3- Une série d'inhibiteurs dérivés des acides triphénylalkyl carboxyliques comportant une fonction alcool terminale primaire à la place de l'acide carboxylique et différant par la longueur de la chaîne alkyle a été testée sur des microsomes hépatiques de rats. Ils exercent un effet inhibiteur puissant et compétitif vis-à-vis de la glucuronoconjugaison de la bilirubine. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre les bases moléculaires stériques et électroniques de l'interaction des substrats avec les UDP-glucuronosyltransférases.


  • Résumé

    New UDP-glucuronosyltransferases inhibitors have been designed, synthetized and tested in order to probe the active sites of these proteins which are involved in the metabolism of xenobiotics, such as drugs, and endobiotics such as bilirubin, retinois acids,. . . The synthetized molecules, whose stucture is analogous to the donor substrate UDP-glucuronic acid, allowed us to characterize more specifically the peptidic domain interacting with this substrate. The maiIÏ results are gathered in three different parts, according to the group of inhibitors considered. 1- Uridine being the mother compound, a chemical series of about fifty molecules has been synthetized by varying the nature of the chemical groups placed successively on the base moiety or on the 2', 3' and 5' positions of the sugar. The inhibitory effect has frrst been estimated in terms of IC50. For the most powerful inhibitors, a detailed kinetic study gave us the inhibition constant and the type of inhibition. 2- These inhibitors have been compared to those previously obtained in the laboratory, such as arylalkyl carboxylic acids (competitive inhibitors) and N-acyl-phenylamino alcohols attached to a uridine molecule by a spacer (transition-state analogs). They have been used to characterize binding site of 4-methylumbelliferone of the UDP-glucuronosyl transferase 1. 6 after mutation of amino-acids His54 and Arg52 (mutants H54A, H54Q and R52A). 3- A series of inhibitors derived from triphenylalkyl carboxylic acids containing a primary alcohol group instead of the carboxylic acid group and with various carbon chain length has been tested on rats hepatic microsomes. They show a strong inhibitory effect on bilirubin glucuronidation. The results obtained allowed us to better understand the molecular and electronic basis of substrates interaction with UDP-glucuronosyl transferases.

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