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des thèses françaises
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Remodelage du site de fixation du NAD(P) dans la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase : analyse biochimique et spectroscopique de la spécificité de cofacteur et de la stéréospécificité de transfert d'hydrure
| Auteur / Autrice : | Jacqueline Eyschen |
| Direction : | Bernard Vitoux, Manh Thông Cung |
| Type : | Thèse de doctorat |
| Discipline(s) : | Biochimie, Biologie Moléculaire et Enzymologie |
| Date : | Soutenance en 1997 |
| Etablissement(s) : | Nancy 1 |
| Partenaire(s) de recherche : | autre partenaire : Université Henri Poincaré Nancy 1. Faculté des sciences et techniques |
Mots clés
Résumé
Au cours de ce travail, nous avons contribué à l'étude structurale du site du cofacteur des oxydoréductases à NAD(P) par ingénierie protéique, modélisation moléculaire et résonance magnétique nucléaire (RMN) en prenant comme modèle la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) glycolytique NAD-dépendante. Nous avons plus particulièrement étudié par RMN du phosphore 31 une série de mutants conçus pour accepter le NADP+ au lieu du NAD+. L'évolution de la forme et du déplacement chimique des résonances du NADP+ en fonction du rapport cofacteur/enzyme et en fonction du pH nous ont permis de mettre en évidence le rôle d'antidéterrninant joué par le résidu D32 dans la fixation du NADP+. La présence de ce résidu se traduit par un pKa élevé du 2'-phosphate du NADP+ qui devient monoanionique à pH neutre dans le mutant L187A-P188S. Ce pKa chute de plus de 2,2 unités pH dans les triples mutants D32G/A-L187A-P188S où l'on observe alors une meilleure affinité pour le NADP+ que pour le NAD+. L'étude d'un quintuple mutant contenant les acides aminés présents dans le site de fixation du cofacteur des GAPDH chloroplastiques à dualité de cofacteur NAD(P) suggère que le 2'-phosphate est à l'état dianionique lorsque le NADP+ est fixé à cette enzyme, ce qui exclut la possibilité d'une liaison hydrogène directe entre le 2'-phosphate et la chaîne latérale du résidu D32. [. . . ]