Relations structure-fonction de canaux potassiques vegetaux : analyse fonctionnelle en systemes heterologues de canaux mutants

par GUY LEMAILLET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées. Sciences médicales

Sous la direction de Hervé Sentenac.

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  • Résumé

    Ce travail porte sur la relation structure-fonction des canaux potassiques vegetaux akt1 et kat1. L'approche repose sur la caracterisation fonctionnelle en systeme heterologue (levure ou ovocyte de xenope) de canaux mutants (mutagenese dirigee ou aleatoire). Les experiences concernent le role (1) de la region c-terminale distale conservee chez akt1 et kat1 (2) de la region homologue du domaine h5 implique dans la selectivite ionique des canaux potassiques animaux. (1) des canaux akt1 et kat1 tronques du domaine c-terminal distal (identifie par des experiences de type double-hybride comme implique dans des interactions au sein de la structure tetramerique du canal fonctionnel) presentent des caracteristiques distinctes de celles des canaux sauvages mais restent fonctionnels. Cette region c-terminale intervient donc dans la regulation de l'activite des canaux, mais n'est pas indispensable a la formation de la structure tetramerique fonctionnelle. (2) des canaux mutants kat1 obtenus par mutagenese aleatoire dans la region h5 ont ete cribles par expression fonctionnelle dans la levure (crible : diminution de la resistance au sel des clones de levure exprimant les canaux mutes). L'analyse des sequences des canaux ainsi selectionnes revele qu'une proportion importante des mutations concerne deux motifs de 3 acides amines, 248vta250 et 271pre273, respectivement en n-terminal et c-terminal de h5 et potentiellement localises dans la bouche externe du pore. Quatres canaux issus du criblage et mutes au niveau du residu t249 de kat1 ont ete exprimes dans l'ovocyte de xenope et caracterises par voltage-clamp a 2 electrodes. Les 4 substitutions diminuent la selectivite du canal en faveur de k + vis-a-vis de na + et li +, et affectent les caracteristiques d'activation et desactivation du canal. En conclusion, le residu t249 est implique dans la selectivite ionique du canal kat1. Il pourrait, avec les residus des deux motifs situes de part et d'autre de h5 et localises dans la bouche externe du pore, former un filtre selectif a l'entree du pore, discriminant k + de na + et li +. Les modifications des caracteristiques d'activation des canaux mutants suggerent que ce site subirait un changement conformationnel lors de l'ouverture du pore.


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Informations

  • Détails : 107 p.
  • Annexes : 187 ref.

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