Developpement et caracterisation d'anticorps monoclonaux pour la quantification des sous-unites de glutenines de haut poids moleculaire du ble

par CHRISTINE DOYEN

Thèse de doctorat en Sciences biologiques fondamentales et appliquées

Sous la direction de MICHEL LAURIERE.

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  • Résumé

    Les selectionneurs du ble, les meuniers et les industriels de la cuisson sont confrontes a la difficulte a evaluer la qualite technologique des bles et des farines. Cette qualite depend en grande partie de la composition du grain en proteines de reserve. Actuellement cette composition n'est pas prise en compte, faute de disposer de dosages fiables, utilisables en routine. L'objectif de ces travaux est de developper un test de quantification des sous-unites de glutenines de haut poids moleculaire (hmw-gs), par une methode immunochimique. La mise au point d'un dosage immunochimique requiert de surmonter deux obstacles : l'isolement d'anticorps specifiques des hmw-gs et la faible solubilite de ces proteines en l'absence de denaturants. Dans ce but, une hmw-gs purifiee est choisie comme immunogene et des milieux d'extraction et de solubilisation des proteines du grain, adaptes a un dosage immunochimique, sont recherches. Apres optimisation de la methode d'extraction selective des hmw-gs et de purification des hmw-gs individuelles par electrophorese et electrotransfert preparatifs, 1 a 3 mg des hmw-gs de la variete elysee sont purifiees. La sous-unite 1d5 est choisie comme immunogene. Elle ne presente, par analyse par electrophoreses 1d et 2d, aucun contaminant proteique. Divers protocoles d'immunisation sont compares et, a l'issue d'une meme fusion, 45 clones d'hybridomes secreteurs d'anticorps anti-hmw-gs sont selectionnes. La caracterisation de la specificite de reaction des anticorps par immuno-empreinte montre que les anticorps de 29 clones sont specifiques des hmw-gs. Vingt anticorps reagissent avec les hmw-gs les plus couramment exprimees et sept anticorps avec un nombre restreint de hmw-gs. Les trois-quarts de ces anticorps reagissent egalement avec des hmw-gs en solution (test de capture de l'antigene realise sur un biocapteur optique). Parmi eux, sept anticorps sont selectionnes en vue de developper le dosage. Les conditions preliminaires du dosage sont definies. Les anticorps selectionnes permettent le dosage des hmw-gs au moyen d'un test elisa sandwich (6 anticorps) ou competitif (1 anticorps). De nouveaux milieux d'extraction et de solubilisation des proteines du grain, compatibles avec une reaction immunochimique, sont proposes. Leur utilisation comme milieu de la reaction immunochimique est envisagee pour assurer la solubilite des antigenes au cours du dosage.


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  • Détails : 203 p.
  • Annexes : 259 ref.

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