Biotinylation des proteines a biotine : caracterisation de l'holocarboxylase synthetase des vegetaux superieurs

par GHISLAINE TISSOT

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Roland Douce.

Soutenue en 1997

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    L'holocarboxylase synthetase catalyse l'incorporation covalente de biotine sur differentes carboxylases, essentielles au metabolisme cellulaire, en permettant leur activation. Les enzymes biotinylees ont ete etudiees chez de nombreux organismes. Chez les vegetaux superieurs, nous avons montre l'existence d'une activite holocarboxylase synthetase, par une methode de dosage enzymatique utilisant de la d-#3hbiotine et de l'apo-bccp bacterienne, comme substrats. La reaction catalysee par l'hcs d'un extrait de plante est atp-dependante. Les valeurs de k#m apparents de l'enzyme de pois pour la biotine et l'atp sont respectivement de 28 nm et 184 m. D'autre part, en utilisant des protoplastes fractionnes de feuilles de pois et des organites purifies, nous avons localise specifiquement l'activite hcs dans le cytosol, les chloroplastes et les mitochondries. Ces resultats suggerent l'existence de plusieurs isoformes de l'hcs impliquees dans la biotinylation des carboxylases dependantes de la biotine actives dans differents compartiments de la cellule. Par complementation fonctionnelle d'un mutant bacterien avec une banque d'adnc d'a. Thaliana, un adnc complet codant pour l'hcs a ete isole. La proteine codee contient des regions specifiques d'homologie avec les autres biotine ligases connues. La region nh#2-terminale de l'hcs d'a. Thaliana possede toutes les caracteristiques d'un peptide de transit. L'enzyme recombinante surproduite a ete purifiee a homogeneite, permettant ainsi l'etude de ses proprietes cinetiques et de son mecanisme reactionnel. En utilisant des anticorps polyclonaux diriges contre l'hcs recombinante purifiee, l'enzyme codee par cet adnc a ete localisee specifiquement dans les chloroplastes de pois. Ce resultat a ete confirme par des experiences d'immuno-cytochimie sur des coupes fines de tabacs, transformes par la sequence codante complete de l'adnc de l'hcs, via agrobacterium tumefaciens. Les autres isoformes de plante seront caracterisees.


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  • Détails : 167 P.
  • Annexes : 194 REF.

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