17-hydroxysteroide deshydrogenase humaine de type i : analyse des relations structure-fonction par mutagenese dirigee et cristallographie des rayons x

par CATHERINE MAZZA

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de JUAN FONTECILLA CAMPS.

Soutenue en 1997

à l'Université Joseph Fourier (Grenoble) .

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  • Résumé

    La 17-hydroxysteroide deshydrogenase de type 1 (17-hsd1) est responsable de la synthese de l'stradiol, strogene biologiquement actif implique dans le declenchement et la proliferation des cancers du sein hormono-dependants. Cette enzyme appartient a la famille des deshydrogenases reductases a chaine courte dans laquelle les residus ser142 tyr155 et lys159, tres conserves, sont supposes intervenir dans le transfert de proton. La 17-hsd1 presente une specificite exclusive, mais inexpliquee vis-a-vis des steroides possedant un cycle a aromatique. De plus, elle utilise, in vitro, aussi bien le nad#+ que le nadp#+ comme cofacteur. Au cours de ce travail, nous avons tente d'identifier les interactions qui regissent ces specificites et de proposer un mecanisme reactionnel. Pour ce faire, des mutants s142a, y155f, s142a/y155f, k159m, h221l, h221q et -17-hsd1 (deletion des 38 residus c-terminaux) ont ete construits et exprimes dans le systeme baculovirus-cellules d'insecte. Les parametres de cinetique enzymatique de ces mutants ont ete compares a ceux de l'enzyme sauvage et une etude structurale a ete menee sur certains de ces mutants. Ainsi, des complexes h221l/nadp#+/stradiol, -17-hsd1/nadp#+/estradiol, h221l/nad#+ et h221q/stradiol ont ete resolus respectivement a 2. 7 a, 1. 9 a, 3. 0 a et 2. 7 a de resolution. Ces structures nous montrent une image detaillee des interactions enzymes-nadp#+ dans lesquelles intervient une boucle mobile (191-199), desordonnee dans toutes les structures precedemment decrites. Stabilisee uniquement en presence de cofacteur, cette boucle se rabat sur le site actif et le protege du solvant. De plus, le residu phe192 stabilise le groupement nicotinamide par un contact hydrophobe fort. Conjointement, ces deux elements favorisent le transfert d'hydrure. Par ailleurs, le groupement 2-phosphate du nadp#+ est stabilise par deux interactions ioniques avec les residus arg37 et lys195 et par une liaison hydrogene avec la ser11. Cette stabilisation demontre la preference de l'enzyme pour le coenzyme nadp(h) et souligne l'originalite de la 17-hsd1 dans laquelle un des deux residus basiques est situe en dehors du motif rossmann fold. De plus, l'analyse des proprietes catalytiques et du mode de liaison de l'stradiol pour les deux mutants h221l et h221q suggere que la liaison hydrogene normalement observee entre le residu his221 et l'oxygene o#3 du steroide joue un role primordial dans le determinisme de la specificite de l'enzymze vis-a-vis des substrats possedant un cycle a aromatique. Enfin, l'analyse structurale du site catalytique des complexes ternaires associee a la perte d'activite enzymatique des mutants s142a, y155f, s142a/y155f et k159m nous a permis de proposer un mecanisme catalytique dans lequel le residu tyrosine jouerait le role d'acide en donnant son proton a l'oxygene o#1#7, le residu serine stabiliserait l'intermediaire reactionnel et contriburait a reduire le pka de la tyrosine alors que le role principal de la lysine serait de stabiliser le groupement nicotinamide.

  • Titre traduit

    Human type i 17-hydroxysteroid dehydrogenase : site directe mutagenesis and x-ray crystallography structure-function analysis


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Informations

  • Détails : 214 P.
  • Annexes : 152 REF.

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