Separation des sous-unites et de la tubuline : proprietes structurales et fonctionnelles

par ANNE GIRAUDEL

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Didier Job.

Soutenue en 1997

à Grenoble 1 .

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  • Résumé

    La tubuline est un heterodimere forme de deux sous-unites : et. Cet heterodimere peut non seulement s'autoagreger et s'organiser pour former des microtubules, elements cles du cytosquelette des cellules eucaryotes, mais il possede aussi de multiples activites biochimiques comme la liaison d'ions, de proteines, ou de drogues antimitotiques comme la colchicine, ou encore il est le substrat de multiples reactions enzymatiques. Une etude des proprietes structurales et fonctionnelles de chacune des sous-unites a ete entreprise en mettant au point une methode de separation physique des chaines polypeptidiques des sous-unites en conditions non denaturantes. La dissociation du dimere de tubuline est obtenue en fixant specifiquement la sous-unite a une resine immunoabsorbante et en utilisant un tampon tris-hcl a un ph legerement alcalin pour eluer la sous-unite , non reconnue par l'anticorps. Cette resine est constituee de l'anticorps yl1/2, specifique de l'extremite carboxy- terminale de la sous-unite tyrosinee, couple a du sepharose 4b. L'effet du tampon tris sur le dimere de tubuline n'est pas denaturant. D'une part, des spectres de dichroisme circulaire montrent que les sous-unites isolees en tampon tris ne sont pas denaturees et conservent largement une structure secondaire tres organisee ; d'autre part, une etude de la liaison de la colchicine au dimere de tubuline montre que les parametres cinetiques de cette liaison en tampon tris a ph neutre sont identiques a ceux en tampon pem. En revanche, les sous-unites isolees, seules, ne lient pas la colchicine. La perte de fixation de la colchicine par les sous-unites isolees est donc un indice valide pour suivre la dissociation du dimere de tubuline. La fixation prealable de la colchicine au dimere diminue considerablement la dissociation du dimere de tubuline, suggerant que le domaine de fixation de cette drogue pourrait etre localise a l'interface entre les deux chaines. Enfin, dans certaines conditions de tampon, les sous-unites separees peuvent se re-associer en presence de colchicine. Compte-tenu des connaissances acquises sur le comportement de la tubuline en tampon tris, un projet de cristallisation de cette proteine a ete entrepris, conduisant a l'obtention de cristaux de tubuline. L'obtention des sous-unites de tubuline isolees en conditions non denaturantes, ainsi que l'obtention des premiers cristaux de tubuline offre de nombreuses perspectives. Ce travail permettra d'apporter de nombreuses reponses quant aux relations structure/fonction de la tubuline dans la cellule.


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  • Détails : 104 P.
  • Annexes : 212 REF.

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