Etude mécanistique de la reverse gyrase de sulfolobus acidocaldarius, une topoisomérase I hyperthermophile

par Anne-Cécile Declais

Thèse de doctorat en Biophysique moléculaire

Sous la direction de Michel Duguet.


  • Résumé

    Les topoisomérases sont des enzymes ubiquitaires qui interviennent dans tous les processus du fonctionnement des génomes pour dénouer les enchevêtrements des molécules d'ADN. Parmi ces enzymes, la reverse gyrase a la particularité de surenroulé positivement l'ADN. Elle n'existe que chez les organismes hyperthermophiles, et joue probablement un rôle clef dans leur adaptation à la vie à haute température. L'analyse de sa structure primaire suggère qu'elle comprend un domaine de type « hélicase » et un domaine topoisomérase, ce qui a conduit à suggérer un modèle de surenroulement positif par la reverse gyrase. Nous avons entrepris de tester ce modèle et de caractériser la fonction de certains motifs identifies dans la séquence de l'enzyme. Ne disposant pas d'outils génétiques chez S. Acidocaldarius, nous avons mis au point un système d'expression hétérologue chez E. Coli, qui permet l'obtention d'une reverse gyrase recombinante qui surenroule positivement l'ADN en présence d'ATP et à 75°C. De plus, le domaine C-terminal, exprimé seul, porte une activité ATP-indépendante de relaxation de l'ADN a 75°C, ce qui confirme que ce domaine est à lui seul une topoisomérase, dont l'activité, au sein de la reverse gyrase, est contrôlée par le domaine « hélicase ». A l'aide de ce système, nous avons réalisé une étude par mutagenèse dirigée qui montre que la tyrosine 964 est le résidu catalytique du domaine topoisomérase, et que les motifs ATPase putatifs sont effectivement impliqués dans la fixation et l'hydrolyse de l'ATP. Enfin, les motifs putatifs en doigt de zinc ne sont pas indispensables à l'activité de surenroulement positif et leur rôle reste inconnu. Afin de mieux comprendre comment s'effectue le couplage des activités des deux domaines de la reverse gyrase, nous envisageons de réaliser de nouveaux mutants et d'analyser les activités helicase, ATPase, de fixation de l'ATP et de fixation non-covalente a l'ADN des différents mutants.

  • Titre traduit

    Mechanistic study of sulfolobus acidocaldarius reverse gyrase, a hyperthermophilic topoisomerase I


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Informations

  • Détails : 1 vol. (205 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 204 réf.

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  • Non disponible pour le PEB
  • Cote : TH 58739
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