Mise au point de sondes adn pour la detection et la caracterisation des rhizobium : application a l'isolement a partir du sol des rhizobium symbiotes du haricot

par VALERIE MACHERET

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Noëlle Amarger.

Soutenue en 1997

à Dijon .

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  • Résumé

    Pour ameliorer les connaissances sur l'ecologie de rhizobium, il est necessaire d'etudier les populations isolees a partir du sol en evitant le biais lie a l'utilisation de la plante-hote. Neanmoins, l'etude des populations naturelles du sol presente une difficulte d'ordre methodologique, qui est l'isolement direct a partir du sol, faute de milieu de culture specifique. Les isolements realises recemment ont ete possibles grace a la mise au point de milieux semi-selectifs augmentant la proportion de rhizobium par rapport a la microflore totale cultivable et de sondes nucleiques pour la detection des especes. Des outils a la fois universels pour tous les rhizobium tout en etant specifiques de ce groupe de micro-organismes taxonomiquement et phylogenetiquement heterogenes ne sont cependant pas disponibles. De meme, peu d'outils specifiques d'especes de rhizobium particulieres ont ete actuellement decrits. La mise au point de tels outils moleculaires a constitue l'un des objectifs de cette etude. Nous avons developpe d'une part une sonde nucleique, nodd, capable de detecter les souches representant les differents genres et especes de rhizobium. D'autre part, des sondes oligonucleotidiques ont ete definies pour chacune des especes nodulant le haricot, r. Gallicum, r. Giardinii, r. Etli, r. Leguminosarum, r. Tropici iia et r. Tropici iib par comparaison des sequences d'adnr 16s de rhizobium et de genres bacteriens phylogenetiquement proches. Un preliminaire a cette etude a ete la determination des sequences d'adnr 16s qui n'etaient pas disponibles pour les especes r. Gallicum et r. Giardinii. Ces travaux ont permis de preciser leur position phylogenetique au sein du genre rhizobium. Les oligosondes ainsi definies se sont revelees specifiques par hybridation de colonies pour chacune des differentes especes symbiotes du haricot. L'utilisation conjointe de milieux de culture semi-selectifs, de procedure de contre-selection sur milieu de culture et des sondes moleculaires ont permis, d'une part l'isolement de sols de culture de communautes de rhizobium de specificite d'hote a priori inconnue, d'especes potentiellement capables de noduler le haricot, r. Leguminosarum bv. Phaseoli et r. Giardinii, de souches de r. Leguminosarum bv. Viciae et de bacteries phylogenetiquement apparentees aux rhizobium, mais egalement une part importante de r. Leguminosarum depourvus d'information symbiotique. Les oligosondes ont egalement permis de detecter et d'isoler les especes r. Etli, r. Tropici et r. Gallicum dans des echantillons de sol de parcelles inoculees avec ces especes, demontrant ainsi la specificite des outils moleculaires mis au point. Nous avons neanmoins demontre les limites de cette approche pour la quantification des bacteries : instabilite des plasmides symbiotiques chez r. Leguminosarum bv. Phaseoli au cours du procede d'isolement, et phenomenes d'inhibition de la multiplication des cellules en culture.


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  • Détails : 101 P.
  • Annexes : 166 REF.

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