Optimisation de l'expression du gène gus sous contrôle de promoteurs inductibles par des stimuli physiques ou chimiques dans des suspensions cellulaires indifférenciées de tabac (Nicotiana tabacum)

par Hélène Boetti

Thèse de doctorat en Génie enzymatique, bioconversion et microbiologie

Sous la direction de Brigitte Thomasset.


  • Résumé

    Les suspensions cellulaires indifférenciées sont utilisées depuis une trentaine d'années pour produire des métabolites secondaires aux diverses propriétés pharmacologiques ou agroalimentaires. Les métabolites secondaires étant synthétisés particulièrement en fin de phase exponentielle ou en début de phase stationnaire, des stratégies ont été développées pour privilégier soit la production de métabolites secondaires soit la croissance cellulaire. Ainsi, la production de ces molécules peut être induite par des stimuli externes. Dans notre étude, les suspensions cellulaires de tabac sont transformées avec la séquence codante du gène gus. Le promoteur qui contrôle son expression a soit une origine végétale (pats1A, pSalT, pCu, Zn SOD et pIn2-2) soit est issu de microorganismes (pMre et pTet). Les inducteurs sont respectivement la lumière (stimulus physique), l'acide abscissique, les antioxydants, le N-aminocarbonyl-2-chlorobenzène sulfonamide, le cuivre et la tétracycline (stimuli chimiques). La potentialité des séquences promotrices à contrôler l'expression d'un gène, appelée efficacité du promoteur, est évaluée par le dosage des activités gus avant et après traitement avec les inducteurs. Pour chaque type de construction (promoteur inductible-séquence codante gus), les conditions optimales d'induction ont été déterminées. Les paramètres à maîtriser sont la concentration en inducteur, le temps d'induction et l'âge de la culture représenté par le nombre de jour après le repiquage. Dans les conditions optimales d'induction, une comparaison des réponses est obtenue grâce à une étude de la variabilité interclonale. Les taux d'induction, qui sont égaux aux rapports des valeurs d'activité gus après traitement et des valeurs d'activité gus avant traitement, ont été déterminés. 30% et 40% des clones contenant respectivement les constructions pSalT-gus ou pTet-gus présentent les réponses à l'induction les plus élevées (taux d'induction supérieurs à 1000). Le clone 21 contenant la construction pTet-gus a des valeurs d'activité gus après induction de l'ordre de grandeur de celles obtenues lorsque la séquence codante gus est sous contrôle du promoteur constitutif pCaMV 35S. Cependant, les valeurs d'activité de base (valeurs d'activité gus avant induction) sont trop élevées pour que ce type de construction soit utilisable pour une future production de molécule d'intérêt en bioréacteur. Ces valeurs d'activité de base peuvent être certainement réduites en modifiant la structure du promoteur pTet. En conclusion, le promoteur pSalT donne la meilleure réponse à l'induction. L'expression du gène gus est nulle en absence d'inducteur dans le milieu de culture, et est importante lorsque celui-ci est ajouté. De plus, dans les conditions optimales d'induction, l'ABA n'est pas toxique vis-à-vis des cellules végétales.

  • Titre traduit

    Improvment of gus gene expression monitored by promoters which are inducible by physical or chemical stimuli in tobacco (Nicotiana tabacum) non-differentiated cell suspensions


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Informations

  • Détails : 1 vol. (210 p.)
  • Notes : Publication autorisée par le jury
  • Annexes : Bibliogr. 250 réf.

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  • Bibliothèque : Université de Technologie de Compiègne. Service Commun de la Documentation.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : 1997 BOE 1007
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