Stades precoces d'embryogenese obtenus apres immobilisation de protoplastes de lin dans une matrice d'alginate de calcium : identification et caracterisation de chitinases parietales

par DAVID ROGER

Thèse de doctorat en Sciences biologiques et fondamentales appliquées. Psychologie

Sous la direction de Hélène David.

Soutenue en 1997

à Amiens .

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  • Résumé

    Des protoplastes d'hypocotyles de lin (linum usitatissimum) immobilises dans des billes d'alginate de calcium (gelification ionotropique) et cultives en presence d'auxines developpent, apres 6 jours de culture, des structures globulaires de type embryonnaire constituees de nombreuses petites cellules extremement cohesives et a cytoplasme dense. Une dissolution de la bille suivie d'une reimmobilisation de ces structures a une faible densite permettent une evolution vers un stade cordiforme. Un autre polymere charge (glucuronane bacterien, eps) gelifie en presence de calcium (gelification ionotropique) et une agarose (gelification thermodependante) ont ete compares a l'alginate de calcium. L'eps permet d'obtenir des structures globulaires qui n'evoluent pas ulterieurement et dont les cellules sont plus vacuolisees. Dans l'agarose, des colonies cellulaires heterogenes ne manifestant aucun signe de morphogenese se developpent. Ces colonies ressemblent a celles formees dans l'alginate de calcium en l'absence d'auxines. Les proteines totales (neosynthetisees et accumulees) a 6 jours de culture et les proteines secretees (retenues dans les parois ou solubles dans le milieu de culture) ont ete analysees par electrophorese nephge-page. Une correlation directe entre des polypeptides basiques retenus au niveau des parois des structures formees dans l'alginate de calcium et le phenotype embryonnaire observe a ete etabli (roger et al. 1996). Des fragments trypsiques obtenus a partir de deux des polypeptides basiques (p183 et p184 m : 25 kd) ont ete sequences. Les sequences peptidiques obtenues (une pour p183 et trois pour p184) sont homologues de chitinases et expriment une activite chitinolytique potentielle en presence de chitine glycol, un substrat des chitinases. Des amorces degenerees, designees a partir de deux hexapeptides choisis dans les microsequences obtenues a partir de p184, ont servi a l'amplification d'une sequence genomique partielle de 626bp (luchif, numero d'accession u94847) comprenant une sequence codante de 222 bp interrompue par un intron. La sequence en acides amines deduite s'aligne sur le domaine catalytique des chitinases. L'hypothese selon laquelle luchif coderait pour p184 est etayee par plusieurs arguments : 1/ son appartenance a un groupe de chitinases extracellulaires de gymnospermes et d'angiospermes, dont les sequences divergent fortement des autres chitinases extracellulaires ou vacuolaires. Ce groupe inclut les chitinases exprimees dans l'embryon somatique (gymnospermes et carotte) et dans la graine (mais). La divergence de ce groupe est bien visible sur l'arbre phylogentique presente (logiciel darwin). 2/ la conservation des microsequences de p184 sur la sequence en acides amines deduite de luchif et 3/ l'absence de site putatif de glycosylation. Un modele synthetisant la reponse physiologique du protoplaste a l'immobilisation dans l'alginate de calcium est presente. Il suggere un role possible des chitinases extracellulaires dans l'embryogenese somatique.


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  • Détails : 134 P.
  • Annexes : 126 REF.

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  • Bibliothèque : Université de Picardie Jules Verne. Bibliothèque universitaire. Section Sciences.
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