Recherche Avancée

Thèse soutenue

Etudes relative à la régénération et à la transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens chez la Betterave sucrière (Beta vulgaris L. )

FR  |  
EN
Auteur / Autrice : Isabelle Roussy
Direction : Brigitte S. Sangwan-Norreel, Rajbir S. Sangwan
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Biotechnologie végétale
Date : Soutenance en 1997
Etablissement(s) : Amiens

Résumé

FR

Nous avons mis au point un protocole de régénération indirecte efficace chez la Betterave sucrière, à partir de fragments de limbes foliaires de plantes, cultivées en serre, et traitées par un inhibiteur du transport auxinique, tel que l'acide 2,3,5 tri-iodobenzoique (TIBA) ou l'acide 1-N-naphtylphthalamique (NPA). Divers milieux d'induction ont été testés, et des plantes morphologiquement normales ont pu être régénérées, à partir des cals issus des explants foliaires mis en culture. Nous avons mis en évidence la nécessité de l'apport de thidiazuron (TDZ), dans le milieu de callogenèse, pour la régénération indirecte de bourgeons. Dans nos conditions, 50% des génotypes testés étaient caulogènes. Une fois le protocole de régénération mis en place, nous avons essayé d'établir un système de transformation génétique par Agrobacterium tumefaciens à partir de fragments de limbes foliaires. Malheureusement, ce type d'explant n'est pas ou peu susceptible à la transformation indirecte. L'étude de l'influence de différents paramètres du protocole de transformation génétique, sur des fragments de limbes foliaires de vitro plants, a mis en évidence l'effet négatif de la préculture et l'inhibition de l'activation des gènes de virulence, par l'acétosyringone, après une journée de prétraitement. De plus, les cellules épidermiques, compétentes à la transgenèse, dégénèrent sur le milieu de sélection, bien que la régénération à partir d'explants foliaires de vitro plants soit possible sur un milieu contenant une cytokinine. Nous avons mis au point, en parallèle, un protocole de régénération et de transgenèse d'une lignée de cals autorégénérant de Betterave, obtenue par gynogenèse. Plus de 80% des cals, placés sur un milieu de régénération contenant 0,1 mg/l de benzylaminopurine (BAP) et 5 mg/l de phloridzine (PZ), produisent des plantes haploïdes. L'étude de l'influence de divers paramètres, nous a permis de mettre en évidence la nécessité d'un prétraitement des cals sur un milieu enrichi en acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2,4-D) (4 mg/l), pendant plusieurs repiquages ; et l'importance d'une période de préculture, sur un milieu favorable à la croissance (1 mg/l d'acide naphtalène acétique ou ANA), avant leur transformation. Au bout de 6 mois de sélection, une suspension de cals totalement transformés a pu être ainsi produite. Après un traitement à la colchicine, des plantes dihaploïdes ont été régénérées. Des tests histochimiques, de résistance à l'agent de sélection, ainsi que des analyses moléculaires ont confirmé l'état transgénique de ces plantes