Production chez escherichia coli de l'igf-ii recombine de truite arc-en-ciel (oncorhynchus mykiss) et mise au point de son dosage radioimmunologique. Etude preliminaire de la regulation de la secretion de l'igf-ii chez la truite

par VALERIE GENTIL

Thèse de doctorat en Biologie

Sous la direction de P.-Y. LEBAIL.

Soutenue en 1996

à Rennes 1 .


  • Résumé

    Les insulin-like growth factors ou igf (igf-i et igf-ii) sont des polypeptides mitogenes important dans la croissance et le developpement et ils ont ete tres etudies chez les mammiferes. Cependant, l'application des techniques mammaliennes aux teleosteens a pose de nombreux problemes d'heterologie et n'a pas permis de comprendre leurs roles chez les poissons pour lesquels, les etudes demeurent peu nombreuses. La mise au point d'outils homologues ayant deja ete effectuee pour l'igf-i de salmonides, nous avons focalise notre travail sur l'igf-ii. Dans un premier temps, l'adnc de l'igf-ii de truite arc-en-ciel (oncorhynchus mykiss) a ete clone par rt-pcr et a ensuite ete introduit dans un vecteur d'expression bacterien (parhs3) pour la production chez e. Coli de sa proteine recombinee (rtigf-ii). Les corps d'inclusion bacteriens contenant 10 a 15% de rtigf-ii ont ensuite ete solubilises et la proteine a ete purifiee. Plusieurs protocoles de purification ont ete testes (chromatographie d'echange d'ions et filtration sur gel). Les meilleurs resultats ont ete obtenus par chromatographie de filtration sur gel en conditions denaturantes (rendement de purification final de 14% par rapport a la quantite totale de proteines bacteriennes contenues dans les corps d'inclusion) avec une production finale de 820 g/litre de culture bacterienne. L'activite biologique de l'rtigf-ii a ete evaluee par differents tests: capacite de liaison de l'rtigf-ii sur des preparations membranaires de placenta humain et de cerveau de truite, sulfatation du cartilage branchial de saumon, inhibition de la secretion de l'hormone de croissance (gh) par les cellules hypophysaires de truite, et multiplication des spermatogonies de truite. Tous ces tests ont ete effectues en comparaison avec les igf humains utilises comme reference. La proteine rtigf-ii s'est revelee peu active (environ 100 fois moins active que les igf humains), probablement a cause de la mauvaise maitrise des conditions de renaturation. Nous avons alors utilise l'rtigf-ii comme antigene pour obtenir un antiserum chez le lapin (anti-rtigf-ii). Un dosage radioimmunologique (ria) sensible et specifique a ete mis au point en utilisant l'anti-rtigf-ii a la dilution initiale de 1/10 000 eme. La sensibilite du ria est de 0. 1 ng/ml, ed50 de 0. 75 0. 06 ng/ml, et les variabilites intra et inter dosage sont respectivement de 4% (n=6) et de 4. 6% (n=9). Les hormones hypophysaires de truite, l'insuline bovine et les igf humains ne croisent pas avec l'antiserum. Des reactions croisees de 0. 1 et 1% ont ete detectees avec l'insuline purifiee de saumon et l'igf-i recombine de saumon, respectivement. Il semble que les proteines porteuses des igf dans le serum (igfbp) interferent dans le dosage. Elles ont donc ete eliminees des echantillons plasmatiques par la technique d'extraction au sephadex sp c-25. Les taux d'igf-ii seriques sont d'environ 20 a 30 ng/ml, ils sont plus faibles que chez les mammiferes. Enfin, nous avons debute une etude sur la regulation hormonale de la secretion de l'igf-ii chez la truite, en nous interessant principalement a sa regulation par la gh. In vitro, la secretion hepatique de l'igf-ii a ete augmentee par des doses croissantes de gh, de facon significative des 10 ng/ml (culture d'hepatocytes de truite en agregats). In vivo, cette action n'a pas pu etre observee (etudes des secretions journalieres d'igf-ii, effet d'une augmentation et d'un effondrement des niveaux circulants de gh sur l'igf-ii plasmatique). Les autres hormones testees (insuline, higf-i et t3) n'ont pas eu d'effet sur les niveaux seriques et les secretions hepatiques d'igf-ii


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Informations

  • Détails : 183 P.
  • Annexes : 254 REF.

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  • Bibliothèque : Université de Rennes I. Service commun de la documentation. Section sciences et philosophie.
  • Disponible pour le PEB
  • Cote : TA RENNES 1996/132
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